论文部分内容阅读
肝肺综合征（hepatopulmonary syndrome，HPS）是一种因肝脏受损引起远端器官肺发生严重病理改变的疾病，以“慢性肝病-肺微血管扩张和增生-低氧血症”为主要特征。在此病理过程中，慢性肝病产生大量的刺激因子（如细胞因子、生长因子、趋化因子等），通过血液循环到达肺脏，作用于肺微血管内皮细胞（pulmonarymicrovascular endothelial cells，PMVECs），导致肺内微血管扩张和增生，使肺部发生氧合障碍出现低氧血症。目前，HPS的发病机制尚不明确。动物实验研究发现大鼠胆总管结扎（common bileduct ligation, CBDL）后肺动脉管壁增厚导致了阻塞性肺血管病变，我们的前期研究发现CBDL大鼠血清可以促进肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）发生表型转换和增殖。此外，大量研究表明PASMCs表型转换和增殖是低氧性肺血管重建的核心变化。这些结果提示低氧环境可能促进HPS大鼠PASMCs发生表型转换和增殖，导致肺动脉管壁增厚，从而加重了肺部低氧血症，促进了HPS的发生发展。但是，在HPS患者中是否也发生PASMCs表型转换和增殖，尚不清楚，值得进一步研究。而黄疸多见于慢性肝病患者，鉴于此，我们推测：慢性肝病产生大量细胞因子、趋化因子及生长因子释放入血，通过血液循环达到肺脏，作用于PASMCs引起了肺血管的病理性重建，导致了HPS的发生发展，这就是本课题立题的目的。本课题通过原代培养成人PASMCs，观察黄疸患者血清调节人PASMCs增殖及表型转换的变化，同时，检测肝硬化患者血清中细胞因子的变化情况，筛选出起关键作用的细胞因子，从而为HPS的防治提供新的靶点。研究内容：1.应用含适量的PDGF的高糖培养基原代培养成人PASMCs，运用光镜、免疫荧光染色法进行鉴定。2.黄疸患者血清的收集，分别用正常和黄疸血清刺激人PASMCs，用CCK-8分别检测其增殖情况，Western blot检测其calponin和α-SM-actin蛋白的变化情况。3.应用luminex-XMAP液相芯片检测肝硬化患者血清中61种细胞因子的变化情况研究结果：1.应用改良的成人PASMCs培养方法进行原代培养，细胞在光镜下呈梭形，细胞之间突起相互接触，可见典型的“峰-谷”征象，细胞内calponin和α-SM-actin蛋白经免疫荧光染色鉴定均为阳性，说明了人PASMCs培养成功。2.黄疸患者血清促进人PASMCs的增殖。与正常血清刺激人PASMCs比较，黄疸血清刺激人PASMCs的体外增殖能力明显增强。在不同时间段内，48h内的增殖能力最强，虽然48h到72h增殖能力较弱，但仍比24h内增殖能力强。说明了黄疸患者血清可以促进人PASMCs在体外增殖。3.黄疸患者血清促进人PASMCs发生表型转换作用24h后，western bolt检测结果发现，与正常血清相比，黄疸血清刺激α-SM-actin蛋白变化不明显，而calponin蛋白却表达升高。但是，随着作用时间延长，48h和72h后，黄疸血清刺激α-SM-actin和calpnion蛋白的表达均明显减少。4. luminex-XMAP液相芯片检测结果显示61种细胞因子中，IL-6，IL-8，IL-15，IL-16，IL-23，TNF-α，IL-28A，LIF，I-309，IP10，MCP-4，6Ckine，BCA-1，MIP-1δ，INF-γ表达明显升高，而其他的细胞因子（如IL-3、IL-7、TRAC、TRAIL、GRO、MCP-1、MCP-2、ENA-78及sCD40L）表达明显下降。结论：1.改良的成人PASMCs培养方法克服了成人肺动脉平滑肌细胞培养困难的问题，同时将人PASMCs应用于实验更符合人体形态学及生物学特征。2.黄疸患者血清促进人PASMCs体外发生表型转换和增殖。3.通过luminex-XMAP液相芯片技术筛选出肝硬化患者血清中的变化较为明显的细胞因子，为进一步研究肝源性肺疾病机制提供科学依据。