论文部分内容阅读
前言阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的神经变性疾病，是导致痴呆的主要病因，发病率随年龄而增加。AD患者典型的临床表现是进行性近期记忆力减退，疾病的晚期出现神经症状和行为异常。AD的主要组织病理学特征是：患者脑内尤其是海马和新皮质出现大量的神经纤维缠结（Neurofibrillary tangles）、老年斑（Senile plagues）及胆碱能神经元缺失、颗粒空泡样变性。细胞内的神经纤维缠结由高度磷酸化的细胞骨架tau蛋白相互缠绕成神经丝构成，而细胞外的老年斑是β-淀粉样前体蛋白经蛋白水解产生的一系列长短不等的Aβ（39-43氨基酸）肽的沉积。尽管AD病因未明，但大多数学者认为β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）的神经毒作用是AD形成和发展的关键因素。对AD患者的尸检发现，患者脑内胆硷能神经通路变性及胆碱乙酰基转移酶耗竭，这些改变被认为与AD患者的临床表现有关。所以，胆碱能替代疗法常被用于治疗AD引起的记忆及认知障碍。这类药包括：乙酰胆碱前体、促乙酰胆碱释放剂、胆碱酯酶抑制剂、毒蕈胆碱能受体激动剂。其他种类药物有：脑血管扩张剂、中枢神经系统兴奋剂、鸦片拮抗剂及神经肽。然而，上述药物都不能逆转AD患者的症状或阻止AD病情的进展。近年来神经科学的研究发现，神经生长因子（nerve growth factor，NGF）对中枢神经系统多种类型神经元的生长、发育、分化、维持和损伤修复都具有重要作用。NGF也是胆碱能神经元重要的营养因子，它能增加乙酰胆碱转移酶的合成，还能阻止实验性损伤、生理性或病理性衰老以及AD等因素引起的胆碱能神经元变性。这些研究成果虽然为应用NGF治疗AD奠定了基础，但由于NGF分子量较大，难于透过血脑屏障进入脑内，使其临床应用受到限制。有人采用向侧脑室或脑实质内直接注射NGF、或向脑内植入表达NGF的基因片断等方法避开血脑屏障。由于这些方法不但手术风险大、费用昂贵而且会导致感染、副损伤等严重的并发症，因而不能在临床上广泛应用。直到1995年，Frey等人发现NGF及其它种类的营养因子（如IGF-Ⅰ），可以通过鼻腔给药经嗅神经或三叉神经通路进入脑内，这一发现为NGF提供了一条到达脑内的非创伤性给药途径。此后，国外有学者相继采用经鼻腔给予转基因AD动物模型NGF的方法，预防转基因动物出现AD样病理改变，取得了比较理想的疗效。然而，AD病因错综复杂，基因变异导致的遗传性AD病例仅占AD患者的10％，绝大多数AD患者是由其它原因引起的散发病例。因此，研究经鼻腔给予NGF对非转基因AD动物模型是否具有神经保护作用是非常必要的，目前国内外尚无相关报道。本研究利用向大鼠侧脑室注射三氯化铝的方法建立非转基因AD大鼠模型，通过观察经鼻腔给予NGF对铝中毒AD大鼠模型行为学、组织学及生物化学等方面的影响，综合评价经鼻腔给予NGF对铝毒性AD大鼠模型的神经保护作用，并初步探讨NGF可能的作用机理，为采用鼻腔给予NGF这一非创伤性途径治疗AD提供理论依据。实验方法利用向大鼠侧脑室注射三氯化铝（AlCl3）的方法建立AD模型。应用Morris水迷宫、苏木素-伊红（Hematoxylin and Eosin，HE）染色、免疫印记（Western blot）、免疫组化ABC染色等技术，观察铝中毒大鼠空间学习记忆能力、大脑皮层和海马神经元数量形态、β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）和ADAM10表达水平的变化，以及经鼻腔给予神经生长因子（NGF）后，对这些变化的影响。实验结果1、Morris水迷宫检测实验组（侧脑室注射AlCl3+鼻腔给予NGF）大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数与对照组（侧脑室注射saline+鼻腔给予saline）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而模型组（侧脑室注射AlCl3+鼻腔给予saline）大鼠逃避潜伏期与对照组比较明显延长、穿越平台次数与对照组比较明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。2、苏木素-伊红（HE）染色对照组及实验组大鼠皮层、海马神经元排列密集、形态正常、胞膜完整；模型组大鼠神经元明显变性缺失、排列稀疏淡染、形态异常、胞膜破损、可见空泡样变。3、免疫印记（Western blot）各组大鼠β-APP表达水平：模型组（整合光密度值：皮层1.28±0.13、海马1.41±0.26）及实验组（整合光密度值：皮层1.16±0.15、海马1.32±0.23）大鼠皮层、海马β-APP含量均明显高于对照组（整合光密度值：皮层0.22±0.04、海马0.31±0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）。各组大鼠ADAM10蛋白表达水平：ADAM10条带在实验组（整合光密度值：皮层0.93±0.16、海马0.98±0.20）颜色深，与对照组（整合光密度值：皮层0.19±0.07、海马0.21±0.06）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；ADAM10条带在模型组（整合光密度值：皮层0.16±0.04、海马0.19±0.05）及对照组颜色均较淡，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。4、免疫组化ABC染色Aβ免疫组化ABC染色显示，对照组Aβ阳性反应物为阴性，说明Aβ在正常状态下几乎不表达或表达极微，实验组亦为阴性；而模型组大鼠皮层及海马均可见较多的Aβ阳性反应物。结论1、经鼻腔给予NGF能对抗铝的神经毒作用，有效地阻止铝中毒引起的学习记忆能力减退、神经元变性缺失等AD样病变的发生，对铝毒性AD大鼠模型具有神经保护作用。2、上调ADAM10的蛋白表达水平，使过度表达的β-APP能通过α-分泌酶途径降解，增加可溶性的α-APPs，阻止不溶性Aβ的形成，可能是NGF对抗铝的神经毒性，发挥其神经保护作用的机理之一。3、上调大鼠海马β-APP基因表达水平，可能是IBA损害海马神经元的分子毒理学机制之一。