论文部分内容阅读
磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）依赖的磷酸酶转移系统（PTS）是大肠杆菌里转运葡萄糖最主要的方式,需消耗磷酸烯醇式丙酮酸。弱化PTS系统,有利于PEP积累,进而提高L-苏氨酸产量。本论文运用大肠杆菌CRISPR基因编辑技术,以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌,通过敲除PTS系统中与转运葡萄糖有关的关键基因（ptsG、ptsH、crr和ptsI）、与RNA聚合酶和PTS系统均相关的rsd基因、与乙醛酸循环相关的基因iclR,过表达与葡萄糖转运相关的基因galP和glk、与TCA循环相关的gltA基因,并转入含有苏氨酸合成途径关键基因的质粒pFW01-thrA*BC-rhtC,构建了苏氨酸生产菌。主要研究结果如下:（1）通过基因敲除确定了大肠杆菌PTS系统中影响L-苏氨酸产量的关键基因。在野生型大肠杆菌MG1655中分别敲除PTS系统中葡萄糖转运关键基因ptsG、ptsH、crr和ptsI,获得突变菌WMZ002、WMZ003、WMZ004和WMZ005。随后,将质粒pFW01-thrA*BC-rhtC分别转入上述突变菌株中。与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC-rhtC相比,前三种重组菌的苏氨酸产量均有提升,其中WMZ004/pFW01-thrA*BC-rhtC的产量最高,将其摇瓶发酵24 h后产量达5.67 g·L-1。ptsG和crr的敲除均可以提高葡萄糖的摄取速度,ptsH的敲除对葡萄糖的摄取有一定的抑制,ptsI的敲除使菌体生长、苏氨酸的产量和葡萄糖的吸收都受到严重抑制。（2）ptsG、ptsH、crr和ptsI中两个或者多个基因的敲除均降低了原来单敲突变菌的L-苏氨酸产量。在野生型大肠杆菌MG1655中分别敲除ptsGH、ptsHcrr和ptsHI-crr,获得突变菌WMZ012、WMZ013和WMZ014,并转入pFW01-thrA*BC-rhtC质粒。与对照菌WMZ004/pFW01-thrA*BC-rhtC相比,上述三种重组菌的苏氨酸产量均下降了,其中WMZ013/pFW01-thrA*BC-rhtC产量最高,将其摇瓶发酵36 h后,产量只有4.41 g·L-1。（3）rsd基因的敲除能提高野生型大肠杆菌和ptsH突变菌的L-苏氨酸产量。在MG1655和WMZ003中敲除rsd基因,获得突变菌WMZ001和WMZ007,并转入pFW01-thrA*BC-rhtC质粒。与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC-rhtC相比,WMZ001/pFW01-thrA*BC-rhtC摇瓶发酵36 h苏氨酸产量达1.85 g·L-1,提高1.76倍。与对照菌WMZ003/pFW01-thrA*BC-rhtC相比,WMZ007/pFW01-thrA*BC-rhtC的36 h摇瓶发酵产量达4.33 g·L-1,提高33.23%。（4）过表达galP基因能提高ptsH敲除突变菌的L-苏氨酸产量和生长糖耗。在WMZ007中过表达galP基因,获得突变菌WMZ010,并转入pFW01-thrA*BC-rhtC质粒。与对照菌WMZ007/pFW01-thrA*BC-rhtC相比,WMZ010/pFW01-thrA*BC-rhtC的摇瓶发酵24 h苏氨酸产量为5.35 g·L-1,提高23.56%。（5）iclR基因的敲除能提高crr突变菌的L-苏氨酸产量,在此基础上过表达gltA基因能进一步提高L-苏氨酸的产量。在WMZ004中敲除iclR基因,获得突变菌WMZ015,在WMZ015中用强启动子trc过表达gltA基因,获得突变菌WMZ016,并转入pFW01-thrA*BC-rhtC质粒。与对照菌WMZ007/pFW01-thrA*BC-rhtC相比,WMZ015/pFW01-thrA*BC-rhtC的摇瓶发酵36 h苏氨酸产量为6.63 g·L-1,提高16.93%。与对照菌WMZ015/pFW01-thrA*BC-rhtC相比,WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC的摇瓶发酵24 h苏氨酸产量为9.21 g·L-1,提高38.91%。（6）50 g·L-1的葡萄糖浓度对WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC的发酵是最适的,达到最大转化率,为0.35 g·g-1葡萄糖。突变菌在30 g·L-1、40 g·L-1、50 g·L-1和60 g·L-1葡萄糖的培养基中发酵36 h,L-苏氨酸产量分别为9.33 g·L-1、13.29 g·L-1、17.23 g·L-1和17.98 g·L-1。