论文部分内容阅读
接合转移作为基因转移工具已在多种链霉菌中成功应用，此方法既可以避开胞外核酸酶使DNA免遭降解，在一定程度上还可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰提高转化效率，目前，肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)的体内遗传操作主要通过原生质体来完成，本研究率先探索了大肠杆菌.肉桂地链霉菌接合转移系统，利用大肠杆菌.链霉菌穿梭质粒，转化ET12567(pUZ8002)，然后接合转移肉桂地链霉菌BIB2005，优化接合转移条件。获得了较好的转化效果。
nsdA基因(negative regulator of streptomyces differentiation)是一个在链霉菌基因组中广泛存在的全局性负调控因子，基因序列保守。迄今为止，nsdA基因改造在工业菌株中的应用还没有相关的报道，本研究率先在肉桂地链霉菌的工业菌株中开展了nsdA的基因中断工作。
本研究利用生物信息学分析基因组已知的阿维链霉菌、天蓝色链霉菌nsdA及相邻序列，设计通用引物P1，P2，在肉桂地链霉菌Bm2005总DNA中扩增nsdA同源基因及其两侧序列的4.8kb的片段并测序验证。合成一对长度分别为58，59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与nsdA基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒(aacr(3)I V+oriT)两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化表达λRed重组酶且含有目标质粒的Escherichia.coli菌株BW25113/pIJ790/pBIB118，获得了阳性重组质粒pBIB929，再接合转移至肉桂地链霉菌BIB2005，筛选得到表型为AptKan的接合子BIB309。PCR验证nsdA基因已被正确中断。与出发工业菌株相比，中断株在形态上较出发菌株发生了较大的变化，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。