论文部分内容阅读
茉莉花(Jasminum sambac(L.)Ait)为木犀科素馨属植物。茉莉花多在夜间开放,是典型的夜花。茉莉花香气四溢,是著名的花茶原料和香精原料。在茉莉花开放过程中,其香气的合成、形态变化及传粉授粉都需要足够的能量,因此茉莉花糖含量是决定茉莉花花发育的重要因素之一。SWEET是最新被发现的一种参与植物光合作用产物运输和分配的糖转运蛋白。此外SWEET蛋白还参与花粉发育、花蜜分泌、胁迫反应等重要生理过程。本课题组前期在茉莉花转录组数据找到了7个在花中特异表达的JsSWEET蛋白家族成员,这些转运蛋白成员在茉莉花开花生理中可能发挥着重要作用。本研究从前期克隆获得的7个JsSWEET家族基因的cDNA全长的基础上进一步运用Gateway融合技术亚克隆得到它们的植物表达载体,同时利用荧光定量PCR技术探究这7个JsSWEET家族基因成员在茉莉花开放前后的表达水平;对蛋白质序列进行进化树构建,并通过瞬时转化茉莉花原生质体确定蛋白的亚细胞定位;选取其中JsSWEET9、JsSWEET5、JsSWEET1、JsSWEET17的表达载体,利用叶盘法转化矮牵牛,成功得到转基因植株;构建酵母表达载体,并且在酵母表达系统中进行糖转运功能互补试验,验证对不同糖类的吸收转运能力。主要研究内容及结果如下:1.对茉莉花中各SWEET基因之间的系统发育关系进行了分析,从NCBI搜索得到模式植物双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻的SWEET蛋白序列,利用MUSCLE和MEGA软件进行进化树的分析与绘制。为明确SWEET基因在开花过程的表达规律,在14:00 h(花苞前)、17:00 h(花苞期)、23:00 h(半开放)、5:00 h(全开)四个时间段采集茉莉花花朵样本,进行了定量PCR的实验分析。提取这四个时间段茉莉花总RNA并反转录合成cDNA第一链。运用实时荧光定量PCR对7个JsSWEET基因进行检测,结果表明JsSWEET1、JsSWEET2、JsSWEET5、JsSWEET9、JsSWEET10基因在23:00 h时表达量最高,JsSWEET16基因在17:00 h时表达量最高,JsSWEET17基因在14:00 h时表达量最高。2.构建了植物表达双元载体。从前期已获得的含有JsSWEET家族基因的T载体中亚克隆JsSWEET1、JsSWEET2、JsSWEET5、JsSWEET9、JsSWEET10、JsSWEET16、JsSWEET17基因的cDNA序列。选择PK7FWG2载体为骨架载体,运用Gateway融合技术构建带有C-端GFP荧光标记的7个茉莉花植物表达载体,分别命名为PK-JsSWEET1、PK-JsSWEET2、PK-JsSWEET5、PK-JsSWEET9、PK-JsSWEET10、PK-JsSWEET16、PK-JsSWEET17。3.使用原生质体转化方法,在茉莉花原生质体中瞬时表达7个JsSWEET糖转运蛋白,结果发现JsSWEET5和JsSWEET9转运蛋白明显定位在原生质体的质膜上,JsSWEET10及JsSWEET2转运蛋白也主要分布在质膜上,但在胞质的某些细胞器中也有明显分布。JsSWEET16、JsSWEET1和JsSWEET17转运蛋白的亚细胞定位情况基本相似,在细胞质内膜系统分布的荧光较为明显,但都有别于GFP单独表达的细胞质荧光。4.选取PK-JsSWEET1、PK-JsSWEET5、PK-JsSWEET9、PK-JsSWEET17载体转化GV3103农杆菌感受态,利用叶盘法转化矮牵牛。经Kan筛选,得到转基因JsSWEET1植株6株,转基因JsSWEET5植株2株,转基因JsSWEET9植株47株,转基因JsSWEET17植株3株。表型初步观察发现JsSWEET9农杆菌侵染植株表现为植株矮小、叶片变黄、部分植株花冠出现额外的须状或花瓣状;JsSWEET5农杆菌侵染植株表现为植株矮小、部分叶片狭长、花朵变小;JsSWEET1和JsSWEET17农杆菌侵染植株待观察。5.将构建好的7个JsSWEET基因酵母表达载体pRS-JsSWEET1、pRS-JsSWEET2、pRS-JsSWEET5、pRS-JsSWEET9、pRS-JsSWEET10、pRS-JsSWEET16、pRS-JsSWEET17和pRS426对照质粒分别转化酿酒酵母EBYVW4000。通过在麦芽糖为底物的SD(-ura)培养基中选择后,再将转化不同基因的酵母菌液分别滴在不同糖底物SD(-ura)培养基中。结果显示pRS-JsSWEET5转基因酵母可以在含有麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖或半乳糖为底物的SD(-ura)培养基上生长,而在脱氧葡萄糖和麦芽糖为共同底物的SD(-ura)培养基上不能生长。pRS-JsSWEET1分别在麦芽糖、半乳糖为底物的SD(-ura)培养基上生长良好。pRS-JsSWEET1、pRS-JsSWEET2、pRS-JsSWEET9、pRS-JsSWEET10、pRS-JsSWEET16、pRS-JsSWEET17和pRS426转基因酵母只能在麦芽糖底物培养基和麦芽糖加脱氧葡萄糖共同底物培养基上生长。以上研究表明JsSWEET5转运蛋白可以转运葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、半乳糖和脱氧葡萄糖;JsSWEET1转运蛋白可能转运半乳糖;JsSWEET2、JsSWEET9、JsSWEET10、JsSWEET16、JsSWEET17,前面预测可能分布在细胞器膜中而不在质膜上表达,因而在本实验中未能确认它们的运输底物。这5个转运蛋白的转运性质有待进一步确认。