血管病变是糖尿病最主要的并发症之一。高糖诱发的炎症和氧化应激导致血管内皮功能受损,并诱导内皮细胞表达多种促炎细胞因子,这些细胞因子和氧化应激之间形成连锁反应,共同促进血管炎症反应。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)是血管壁的重要组成部分,在高血糖和内皮细胞释放的细胞因子作用下发生炎症反应和功能改变,在糖尿病血管病变的发生发展中发挥重要作用。研究表明,锌指转录因子Krüppel样因子5(krüppel-like factor 5,KLF5)在血管重塑中发挥重要作用。在炎症因子刺激下,KLF5可通过激活炎症反应信号通路加重炎症反应。在心血管系统,血管内皮损伤通过诱导KLF5表达而激活参与血管重塑的基因,比如诱导型一氧化氮合酶(inducible NO synthase,iNOS)、血小板衍生生长因子-A/B(platelet derived growth factor-A/B,PDGF-A/B)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)以及血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)是在多种细胞中存在的多能性转录因子,可由多种信号(细菌/病毒感染、细胞因子和氧化应激等)诱导活化。活化的NF-κB进入细胞核与特定靶基因启动子结合并促进其进行转录,这些表达产物参与炎症反应和免疫应答。然而,在糖尿病引发的血管病变中,NF-κB和KLF5之间的相互关系尚不清楚。在心血管系统中,iNOS主要在VSMC中表达,炎症反应可以上调iNOS的表达。研究发现,iNOS与人类许多炎症性疾病有关。有研究显示,2型糖尿病患者心血管系统受损程度与iNOS表达呈正相关。iNOS一旦合成,便催化合成大量的NO,NO与超氧化物(superoxide)相互作用形成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-),后面通过使蛋白质分子中的酪氨酸硝基化显示其细胞毒性。研究发现,在糖尿病小鼠的血管中,酪氨酸硝基化水平显著升高,说明蛋白质硝基化参与糖尿病血管病变的发生发展过程。虽然目前已知糖尿病血管病变与炎症因子和过氧亚硝基阴离子水平增多有关,但是KLF5、NF-κB和iNOS之间的关系以及三者在糖尿病血管病变中的相互作用的机制尚不清楚。为了探讨上述问题,本研究以糖尿病患者动脉血管组织、STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型以及体外培养的VSMC为研究对象,探讨在高糖刺激下,iNOS诱导产生的ONOO-、KLF5以及NF-κB如何参与VSMC的炎症反应,旨在阐明KLF5的硝基化修饰在糖尿病血管炎症中的作用及分子机制,为研发抑制血管炎症反应的药物提供新的靶点。第一部分高糖通过诱导iNOS表达及ONOO-形成促进KLF5表达及硝基化目的:探讨高糖诱导iNOS表达及ONOO-形成与KLF5表达及硝基化之间的关系。方法:1实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测糖尿病患者血管组织中KLF5和iNOS的表达,免疫双荧光染色检测KLF5和iNOS在糖尿病患者血管组织中的表达和定位。2用不同浓度葡萄糖(5.5~25 m M)处理VSMC 12 h或高糖(25 m M)处理VSMC不同时间(0~12 h),qRT-PCR和Western blot检测KLF5和iNOS的表达;给予VSMC高糖(25 m M)处理,免疫荧光染色检测KLF5和iNOS的定位和表达。3用低糖(5.5 m M)+甘露醇(19.5 m M)或高糖(25 m M)处理VSMC12 h,Western blot检测KLF5和iNOS的表达;4用si-Ctrl和si-KLF5转染VSMC 24 h后,分别给予低糖(5.5 m M)和高糖(25 m M)处理,Western blot检测KLF5敲低效率和iNOS的表达。5用低糖(5.5 m M)和高糖(25 m M)处理VSMC,ELISA方法检测培养基中ONOO-浓度。6用不同浓度SIN-1(0~100μM)处理VSMC 12 h或用100μM SIN-1处理细胞不同时间(0~12 h),qRT-PCR和Western blot检测KLF5的表达。7用高糖(25 m M)+不同浓度Fe TPPS(0~100μM)处理VSMC,免疫共沉淀检测KLF5酪氨酸硝基化水平。8分别用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)、不同浓度SIN-1(0~100μM)、高糖(25 m M)+不同浓度Fe TPPS(0~100μM)、不同浓度SIN-1(0~100μM)+Fe TPPS(0~100μM)处理VSMC,免疫共沉淀和免疫双荧光染色检测KLF5酪氨酸硝基化水平。9免疫双荧光染色方法检测非糖尿病患者和糖尿病患者动脉血管组织中KLF5酪氨酸硝基化水平。结果:1糖尿病患者的VSMC中KLF5和iNOS表达升高qRT-PCR结果显示,糖尿病患者动脉血管中KLF5和iNOS的表达较非糖尿病患者上升约3倍。Western blot结果显示,在蛋白水平上,KLF5和iNOS在糖尿病患者动脉血管中也明显升高。免疫双荧光染色结果显示,KLF5和iNOS主要在糖尿病患者的VSMC中进行表达。2在体外培养的VSMC中,高糖诱导KLF5和iNOS表达qRT-PCR和Western blot结果显示,高糖以浓度和时间依赖性的方式诱导KLF5和iNOS表达。在mRNA水平上,KLF5和iNOS水平至少比低糖处理的细胞升高2倍。高糖引起渗透压的改变对KLF5和iNOS的表达无影响。免疫荧光染色结果也显示,高糖能显著诱导KLF5和iNOS表达。用靶向KLF5的si RNA(si-KLF5)敲低KLF5表达后,再用高糖处理VSMC,Western blot结果显示,敲低KLF5后高糖不能再上调iNOS表达,表明KLF5介导高糖对iNOS表达的诱导作用。ELISA结果显示,给予VSMC高糖处理后,细胞培养液中ONOO-浓度明显升高。3高糖通过诱导iNOS表达和ONOO-形成促进KLF5表达和硝基化qRT-PCR和Western blot结果显示,在低糖培养的VSMC中,过氧亚硝基供体SIN-1能显著诱导KLF5表达,呈浓度及时间依赖性。用抗硝基化酪氨酸抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀后,用抗KLF5抗体进行Western blot的结果显示,过氧亚硝基阴离子分解催化剂Fe TPPS能消除SIN-1诱导的KLF5硝基化,且呈剂量依赖性。免疫共沉淀及免疫双荧光结果显示,高糖或SIN-1均可以诱导KLF5酪氨酸硝基化,Fe TPPS能降低高糖或SIN-1诱导的KLF5酪氨酸硝基化水平。这些结果表明,KLF5酪氨酸硝基化是由ONOO-引起的。对人动脉血管组织切片进行免疫双荧光染色的结果显示,与非糖尿病患者相比,糖尿病患者动脉血管中KLF5酪氨酸硝基化水平明显升高。小结:糖尿病患者的VSMC中KLF5和iNOS表达均升高,高糖能显著诱导体外培养的VSMC表达KLF5和iNOS。iNOS催化产生的ONOO-促进KLF5表达和硝基化。第二部分iNOS产生的ONOO-通过促进KLF5和NF-κB p50硝基化及两者相互作用而上调炎性因子基因表达目的:揭示ONOO-促进炎症细胞因子表达的分子机制。方法:1用不同浓度葡萄糖(0~25 m M)处理VSMC 12 h或用高糖(25 m M)处理细胞不同时间(0~12 h),Western blot检测NF-κB p50蛋白表达。2分别用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)、SIN-1(100μM)、高糖(25 m M)+不同浓度Fe TPPS(0~100μM)处理VSMC,Western blot检测NF-κB p50表达。3用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)、SIN-1(100μM)、高糖(25 m M)+不同浓度Fe TPPS(0~100μM)处理VSMC,免疫共沉淀检测NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平、KLF5和NF-κB p50相互作用以及KLF5和NF-κB p50硝基化对其相互作用的影响。免疫双荧光染色检测KLF5和NF-κB p50的相互作用。4用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)、SIN-1(100μM)、高糖(25 m M)+不同浓度Fe TPPS(0~100μM)处理VSMC,qRT-PCR和Western blot检测炎症相关基因的表达。免疫荧光染色检测炎性因子的定位和表达。5用si-KLF5敲低KLF5表达或用Ad-KLF5过表达KLF5,再分别用低糖(5.5 m M)、高糖(25 m M)和SIN-1(100μM)处理VSMC,qRT-PCR和Western blot检测炎症相关基因的表达。6 qRT-PCR和Western blot检测糖尿病小鼠主动脉中KLF5、NF-κB p50、iNOS以及炎症相关基因的表达。7免疫双荧光染色检测糖尿病小鼠主动脉VSMC中KLF5的表达。8免疫共沉淀和免疫双荧光染色检测糖尿病小鼠主动脉中KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平。结果:1 KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化使两者相互作用增强Western blot结果显示,高糖以浓度和时间依赖的方式诱导NF-κB p50表达。此外,SIN-1也显著诱导NF-κB p50表达,Fe TPPS可消除高糖对NF-κB p50表达的诱导作用,说明ONOO-介导高糖对NF-κB p50表达的诱导。免疫共沉淀结果显示,与低糖组相比,高糖或SIN-1使NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平增加4-5倍,而Fe TPPS能消除高糖诱导的NF-κB p50酪氨酸硝基化。与低糖组相比,高糖或SIN-1处理VSMC后,KLF5和NF-κB p50之间的相互作用增强。在用KLF5抗体或NF-κB p50抗体免疫共沉淀的沉淀物中,硝基化的NF-κB p50或硝基化的KLF5均显著升高。与此同时,用Fe TPPS清除ONOO-可以消除高糖诱导的KLF5和NF-κB p50之间的相互作用。这些结果表明,高糖或SIN-1诱导的KLF5与NF-κB p50之间的相互作用依赖于KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化。免疫荧光结果也显示,与低糖组相比,高糖或SIN-1处理VSMC后,KLF5和NF-κB p50相互作用增强,高糖+Fe TPPS处理的细胞与单独用高糖或SIN-1处理的细胞相比,KLF5与NF-κB p50的相互作用显著减少。2 KLF5与NF-κB p50相互作用促进炎性细胞因子基因表达Western blot和qRT-PCR结果显示,用高糖或者SIN-1处理VSMC能显著上调IL-1β和TNF-α表达,Fe TPPS可以取消高糖对这两种炎性因子表达的诱导作用。在mRNA水平上,高糖或SIN-1使IL-1β和TNF-α水平至少升高2.5倍。免疫荧光染色也得到了同样结果。用si-KLF5敲低KLF5后,Western blot和qRT-PCR结果显示,在si-Ctrl组,高糖能上调IL-1β和TNF-α表达;但在KLF5敲低组,无论是否给予高糖处理,IL-1β和TNF-α表达均无明显变化。用Ad-KLF5转染VSMC使KLF5过表达后,在mRNA及蛋白水平上,与Ad-GFP组相比,无论是否给予高糖刺激,IL-1β和TNF-α表达均升高10倍以上。用si-KLF5敲低KLF5后,高糖和/或SIN-1,均不再能上调IL-1β和TNF-α表达。这些结果表明,KLF5在高糖诱导炎性细胞因子表达中发挥必不可少的作用。3在VSMC特异性敲除KLF5(KLF5Δ/Δ)的糖尿病小鼠血管中,炎性细胞因子基因表达明显降低STZ诱导的糖尿病小鼠与非糖尿病小鼠相比,血糖显著升高,体重明显下降。而给予STZ的KLF5Δ/Δ小鼠与非糖尿病小鼠相比,血糖虽有升高,但明显低于STZ诱导的糖尿病小鼠,且体重下降不明显。qRT-PCR和Western blot结果显示,与非糖尿病小鼠相比,STZ诱导的糖尿病小鼠主动脉组织中KLF5、NF-κB p50和iNOS的表达均明显升高;而KLF5Δ/Δ小鼠无论是否给予STZ,KLF5、NF-κB p50和iNOS的表达均降低。免疫双荧光染色结果显示,在小鼠主动脉VSMC中,与非糖尿病小鼠相比,STZ诱导的糖尿病小鼠KLF5表达明显增多,在KLF5Δ/Δ小鼠,无论是否给予STZ,都检测不到KLF5表达。用qRT-PCR和Western blot检测小鼠血管组织中炎性基因表达的结果显示,STZ诱导的糖尿病小鼠与非糖尿病小鼠相比,主动脉中IL-1β和TNF-α表达明显增加,而KLF5Δ/Δ小鼠无论是否给予STZ,IL-1β和TNF-α表达都没有明显变化,给予STZ的KLF5Δ/Δ小鼠与STZ诱导的糖尿病小鼠相比,IL-1β和TNF-α表达明显下降。免疫共沉淀结果显示,STZ诱导的糖尿病小鼠主动脉中KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平较非糖尿病小鼠明显升高。免疫双荧光染色结果也显示,糖尿病小鼠主动脉中KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平较非糖尿病小鼠明显升高,而KLF5Δ/Δ小鼠,无论是否给予STZ,KLF5和NF-κB p50的酪氨酸硝基化水平均明显低于非糖尿病小鼠。小结:在VSMC中,高糖诱导的KLF5和NF-κB p50酪氨酸硝基化促进二者结合并协同促进IL-1β和TNF-α基因表达。在VSMC特异性敲除KLF5的糖尿病小鼠血管或敲低KLF5的VSMC中,IL-1β和TNF-α基因表达明显下降。KLF5在高糖诱导炎性细胞因子表达中发挥必不可少的作用。第三部分17β-雌二醇通过诱导ERα与NF-κB p50相互作用而阻抑KLF5与NF-κB p50的结合,进而抑制炎性细胞因子表达目的:探索17β-雌二醇抑制高糖诱导血管炎症反应的分子机制。方法:1用高糖(25 m M)+不同浓度17β-雌二醇(0~100 n M)处理VSMC,qRT-PCR和Western blot检测KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表达。2用VSMC高糖(25 m M)、高糖(25 m M)+17β-雌二醇(100 n M)、高糖(25 m M)+17β-雌二醇(100 n M)+雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)阻断剂(ICI182780)(1μM)处理VSMC,qRT-PCR和Western blot检测KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表达,免疫荧光染色检测上述基因在细胞内的定位和表达。3细胞经上述处理后,免疫共沉淀及免疫荧光染色方法检测KLF5与NF-κB p50以及ERα与NF-κB p50的相互作用。结果:1 17β-雌二醇下调高糖诱导的KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表达用VSMC高糖+不同浓度17β-雌二醇(0~100 n M)处理VSMC后,qRT-PCR和Western blot检测炎症相关基因的表达。结果显示,与单独用高糖处理的VSMC相比,高糖+17β-雌二醇处理的细胞中,KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表达均显著下调,且呈剂量依赖性。2 17β-雌二醇通过ERα下调高糖诱导的KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的基因表达用VSMC高糖、高糖+17β-雌二醇、高糖+17β-雌二醇+ICI182780处理VSMC,qRT-PCR和Western blot结果显示,高糖使KLF5、NF-κB p50、iNOS、IL-1β和TNF-α的表达上调;17β-雌二醇能消除高糖对这些基因表达的诱导作用;用高糖+17β-雌二醇+ICI182780处理细胞后,17β-雌二醇对高糖效应的拮抗作用被消除。免疫荧光染色也得到了同样的结果。这些结果表明,ERα介导17β-雌二醇的抗炎作用。3 17β-雌二醇促进ERα与NF-κB p50相互作用,阻抑KLF5与NF-κB p50结合,进而拮抗KLF5和NF-κB p50的协同促炎作用免疫共沉淀结果,在高糖培养的VSMC中,KLF5主要与NF-κB p50结合,ERα与NF-κB p50的结合很少。用高糖+17β-雌二醇共同处理VSMC时,与单独用高糖处理的细胞相比,ERα与NF-κB p50的相互作用显著增强,而KLF5与NF-κB p50的相互作用明显减少。用高糖+17β-雌二醇+ICI182780处理细胞后,17β-雌二醇诱导的ERα与NF-κB p50的相互作用被减弱,说明ICI182780抵消了17β-雌二醇对ERα与NF-κB p50相互作用的诱导。免疫双荧光染色结果显示,用高糖+17β-雌二醇处理VSMC后,与单纯高糖处理的细胞相比,KLF5与NF-κB p50的共定位明显减少,而ERα与NF-κB p50的共定位明显增强。这些结果表明,被17β-雌二醇激活的ERα可与KLF5竞争性地与NF-κB p50结合。用高糖联合+17β-雌二醇+ICI182780处理细胞后,17β-雌二醇诱导的ERα与NF-κB p50的共定位被减弱。上述结果说明,17β-雌二醇通过活化ERα而促进其与KLF5相互作用,并进而减少KLF5与NF-κB p50的结合。小结:ERα介导17β-雌二醇对高糖诱导的炎症相关基因表达的阻抑作用,其作用机制是通过促进ERα与NF-κB p50相互作用,抑制KLF5与NF-κB p50结合来实现的。结论:1糖尿病患者的VSMC中KLF5和iNOS表达均显著升高。2在体外培养的VSMC中,高糖诱导KLF5和iNOS表达。3高糖通过iNOS产生的ONOO-促进KLF5的表达及酪氨酸硝基化。4 KLF5和NF-κB p50的硝基化有利于两者相互作用并协同促进IL-1β和TNF-α表达。5 VSMC特异性敲除KLF5的糖尿病小鼠血管中,炎症相关基因表达明显下降。6 17β-雌二醇促进ERα与NF-κB p50相互作用,抑制KLF5与NF-κB p50结合,进而拮抗KLF5和NF-κB p50的协同促炎作用。