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研究背景牙周炎是由牙菌斑微生物引起的慢性感染性疾病,宿主对微生物产生的不恰当的免疫反应是造成牙周组织破坏的主要原因。大量流行病学研究结果显示,糖尿病是牙周炎发生的重要风险因素,糖尿病患者发生牙周炎的风险比正常人群高3-5倍,而血糖控制情况是增加牙周炎风险的关键因素。因而,牙周炎已被认为是糖尿病的第六大并发症。然而,有关糖尿病增加牙周炎易感性、促进牙周炎发病的病理机制,仍不明确。糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)是常见的慢性内分泌代谢性疾病,同时也是一种慢性炎症性疾病,其在本质上可表现为机体的低度炎症状态(Low-grade Inflammation)。而这种低度炎症状态来源于内源性配体刺激先天免疫细胞产生和分泌前炎症因子,如自由脂肪酸或糖基化终端产物等通过结合Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)激活NF-κB途径,从而诱导白细胞粘附分子的上升和造血细胞和内皮细胞的前炎症因子和造血因子的产生。糖尿病作为一种低度炎症状态表现为多种炎症因子上升,如IL-6、IL-1β等。近年大量研究发现,糖尿病患者TLR2、TLR4在多种组织、细胞中的表达都发生了改变,如外周血单核细胞、脂肪组织、骨组织、肾小管和肾间质,TLR-2、4敲除可减弱了鼠糖尿病和早期糖尿病肾病的低度炎症状态。可见,糖尿病可通过TLRs途径促进包括肾病、血管性疾病等多个相关并发症的发生,但糖尿病是否通过TLRs途径促进牙周炎的进展仍不明确。TLRs是天然免疫系统中特异的Ⅰ-型跨膜受体及病原模式识别受体,在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起重要作用。在炎症疾病的相关报道中,以TLR-2,4的相关研究居多。TLR-2,4不但可以与外源性配体结合,还可以和内源性配体产生反应,包括热休克蛋白、细胞外基质降解产物等。研究发现,TLR-2,4在多种炎症疾病中起重要作用,包括:糖尿病、肾病、炎症性肠炎、风湿性关节炎、心血管、肝炎等。近年来,TLR-2,4在牙周炎发病中的重要作用已逐渐为研究人员所认识。TLRs途径在维持牙周健康和促进牙周炎发生发展中起着非常重要的作用,特别当细菌侵入深层牙龈组织后,TLRs能诱导牙周炎症的发生和加重牙周组织的破坏。因此,TLRs作为一把双刃剑,不仅有助于保持牙周健康,也有助于导致牙周组织破坏。TLR在固有免疫系统中作用机制的揭示将为牙周炎这一感染性疾病的发生发展提供新视野。近来研究表明TLR-2、4在糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病血管性并发症等低度炎症状态中具有关键作用。鉴于TLR-2、4在牙周炎发病中的重要作用,推测糖尿病可能经TLR途径诱导牙周组织发生低度炎症状态,从而增加了糖尿病患者牙周炎易感性,促进牙周炎的发生发展。因此,本研究拟从体内外研究糖尿病状态下牙周组织中TLR2、TLR4及炎症因子表达的调控变化,进而探讨TLR2、 TLR4在糖尿病状态下牙周组织低度炎症状态发生中的作用,为探讨TLR2.TLR4作为防治牙周炎靶点的可行性提供初步研究依据。第一章糖尿病状态下TLR-2、4在大鼠牙周组织中的表达研究第一节糖尿病大鼠模型的建立1.研究目的通过建立2种不同的Ⅱ型糖尿病大鼠模型,即自发性Ⅱ型糖尿病OLETF大鼠模型和链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导性的Ⅱ型糖尿病SD大鼠模型,为进一步研究糖尿病状态下牙周组织TLR-2、4及炎症因子的表达调控奠定基础。2.研究方法模型一:(1)自发性Ⅱ型糖尿病Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF)大鼠:(O组),4周龄,雄性,10只;同种系同周龄糖耐量正常的Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO)大鼠(L组),雄性,8只。每4周行一次口服糖耐量OGTT (oral glucose tolerance test)检测,按2g/kg予50%葡萄糖溶液灌胃,依据OGTT试验的结果判定,同时符合血糖峰值>16.7mmol/L和葡萄糖灌胃后120min血糖>11.1mmol/L时诊断为糖尿病。(2)分别在36周、46周及56周时,监测大鼠体重,并观察其体重和血糖的变化。采用尾静脉采血测定其血清胰岛素水平的动态变化并计算糖尿病胰岛素抵抗稳态模型(Homeostasis model assessment-insulin resistance HOMA-IR)值。(3)56周龄时,处死所有实验大鼠,评估牙龈大体形态、质地,收集颌骨样本,EDTA脱钙后HE染色,观察牙周组织病理改变。模型二:(1)20只9周龄的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠随机分为2组(n=10):糖尿病组(DM),和正常对照组(H);(2)DM组:高脂饮食4周后,通过腹腔内注射STZ(35mg/kg);H组:正常饮食4周后,注射柠檬酸缓冲液(0.25ml/kg)。3天后测血糖,血糖高于16.7mmol/L (300mg/dl)诊断为DM,注射STZ后6周时进行胰岛素挑战实验,判定糖尿病模型成功的建立;(3)25周龄时,处死所有实验大鼠,评估牙龈大体形态、质地,收集颌骨样本,EDTA脱钙后HE染色,观察牙周组织病理改变。3.研究结果一般体征:OLETF大鼠及STZ诱导的糖尿病SD大鼠均出现多食、多饮、多尿、倦怠少动、毛无光泽且凌乱等体征,而LETO大鼠和正常SD大鼠则饮食饮水量正常,精神状态良好,反应灵敏,毛顺光亮。体重变化:两种不同动物模型的体重变化趋势不同。糖尿病自发大鼠模型中,OLETF大鼠随着实验时间进展,其体重逐渐高于同周龄的对照LETO大鼠(F=3.922,P=0.033)(图1-1,表1-1);而药物STZ诱导性糖尿病SD大鼠模型中,糖尿病SD大鼠在高脂饮食阶段的体重略高于对照组,但在注射STD后的体重逐渐低于同周龄的正常组大鼠(F=70.994,P=0.000)。建模指标检测:自发性T2DM大鼠模型中,采用OGTT值计算AUC的结果显示OLETF大鼠的血糖情况,在36周龄时到达IGT期开始进入糖尿病发病的前期,46周龄左右为糖尿病发病的稳定期,模拟了人类T2DM的慢性发病的过程;STZ诱导的糖尿病SD大鼠在注射STZ后3天的随机血糖显著高于正常对照大鼠(t=-39.048,P=0.000),在注射STZ后6周的胰岛素挑战实验显示DM组存在胰岛素抵抗,高脂饮食加STZ诱导的糖尿病SD大鼠成功建立。牙周组织的大体外观情况:对比两组模型的糖尿病组和正常组大鼠的牙龈形状、颜色和质地没有明显差异,牙龈均未发现明显退缩。牙周组织HE染色结果表明:两组模型的正常组和糖尿病组大鼠的牙周组织均表现为龈沟底位于釉牙骨质界处,结合上皮附着紧密,胶原纤维排列有序,牙槽骨无明显吸收,未见明显炎症细胞聚集,牙周组织附着未见丧失。本研究结果提示:糖尿病组与正常组大鼠的牙周组织病理学形态无显著性差异。4.结论本课题组成功建立了OLETF大鼠自发性2型糖尿病模型和STZ诱导性2型糖尿病大鼠模型,糖尿病状态下大鼠的牙周组织形态结构无显著性差异。第二节糖尿病状态下牙周组织中TLR-2、4及炎症因子的表达研究1.研究目的通过检测TLR-2、4及炎症因子在糖尿病大鼠牙周组织中的表达调控,分析糖尿病状态下牙周组织局部免疫防御机制的可能变化。2.研究方法采用免疫组化Envision二步法对大鼠牙龈组织切片进行TLR2、TLR4检测,采用图形分析软件对组织切片染色进行半定量分析。Trizol提取样本总RNA,通过实时荧光定量RT-PCR的方法,以β-actin为内参基因,检测TLR2、TLR4、IL-6、IL-1β和NF-κB p65在大鼠牙龈样品中的转录水平。3.研究结果免疫组织化学检测大鼠牙龈组织中TLR2的表达显示:TLR2主要在牙龈上皮细胞中有表达,并定位于细胞膜和细胞质中。在少量成纤维细胞,炎症细胞和血管内皮细胞也显示有TLR2的阳性表达。在牙龈上皮细胞中,TLR2在上皮基底层和棘层细胞染色最强,向表层细胞表达逐渐减弱。两种模型中糖尿病大鼠牙龈组织TLR2表达水平均显著高于相应的正常大鼠(OLETF:t=-4.085, P=0.001;t--5.078, P=0.000)。IHC检测大鼠牙龈组织中TLR4的表达显示:TLR4与TLR2的表达特征类似,主要表达在牙龈上皮细胞,并定位于细胞膜和细胞质中。在少量成纤维细胞,炎症细胞和血管内皮细胞也显示有TLR4的阳性表达。但在牙龈上皮中,TLR4的表达强度分布与TLR2正好相反,TLR4在上皮表层细胞/棘层细胞染色最强,向基底层细胞表达逐渐减弱。两种模型中糖尿病大鼠牙龈组织TLR4表达水平均显著高于相应的正常大鼠(OLETF:t=-2.623, P=0.020; STZ:t=-3.995, P=0.001)。RT-PCR检测结果显示:两种不同糖尿病模型中大鼠牙龈组织中TLR2和TLR4的mRNA,发现两者的表达水平均高于相应的正常大鼠,且差异有统计学意义(P<0.05)。mRNA相对表达量与免疫组织化学表达结果趋势一致,提示糖尿病促进了大鼠牙龈组织中TLR2和TLR4的表达。相关炎症因子在STZ诱导性的糖尿病SD大鼠模型牙龈组织中的mRNA水平,研究结果显示:糖尿病组大鼠牙龈组织中的前炎症因子IL-1β、IL-6和NF-κB的mRNA水平均高于正常大鼠组,其中IL-1β、IL-6的表达差异有统计学意义(P<0.05)。4.结论在糖尿病状态下,TLR2、TLR4及炎症因子在大鼠牙龈组织中的表达升高,提示糖尿病机体内牙周局部组织的免疫防御机能可能发生改变,使得糖尿病机体在一定程度上更易于罹患牙周炎。第二章TLR-2、4在高糖状态下人牙龈上皮细胞中的体外表达研究第一节高糖状态下人牙龈上皮细胞的生物学特性1.研究目的通过构建人牙龈上皮细胞(human gingival epithelial cells, HGECs)体外高糖培养体系,以模拟糖尿病患者体内高糖环境,探讨高糖对人牙龈上皮细胞生物学特性的影响。2.研究方法在临床上收取18-30岁健康青年牙龈组织,采用酶消化法,体外培养HGECs原代细胞。选取处于对数生长期的第3代细胞用于后续实验。制备细胞爬片,采用细胞免疫组织化学染色检测细胞纯度。具体实验分组如下:(1)高糖组:使用含25mmol/L D-葡萄糖的K-SFM培养基;(2)正常组:使用含5.5mmol/L D-葡萄糖的K-SFM培养基;(3)等渗组:使用含5.5mmol/L D-葡萄糖及19.5mmol/L甘露醇的K-SFM培养基。采用MTS法,检测高糖下人牙龈上皮细胞的增殖情况;采用流式细胞术,检测高糖下人牙龈上皮细胞的生长周期情况及凋亡情况;采用细胞划痕实验,检测高糖对人牙龈上皮细胞迁移能力的影响。3.研究结果免疫细胞化学染色结果显示:牙龈上皮细胞抗角蛋白染色为阳性表达,抗波形蛋白染色为阴性表达,表明细胞是上皮性来源。镜下观察显示:高糖组、等渗组和正常组在原代至第3代细胞的细胞生长状况和形态均相似,无明显差异。MTS检测结果显示:高糖对于人牙龈上皮细胞的增殖活性无显著影响,渗透压也没有改变细胞的增殖活性(P>0.05)。流式细胞术检测结果显示:正常组、高糖组及等渗组人牙龈上皮细胞三组细胞的分裂增殖能力无显著差异(P>0.05);正常组、高糖组及等渗组人牙龈上皮细胞凋亡细胞比例的差异无统计学意义P>0.05)。划痕愈合实验结果显示:划痕24h时,细胞迁移的距离与划痕宽度的比例在正常糖组显著高于高糖组(P<0.05)。4.结论高糖培养下,牙龈上皮细胞形态、增殖及凋亡均未发生显著改变,但高糖在一定程度上削弱了细胞迁移能力,提示糖尿病机体的牙周组织愈合能力可能弱于正常机体。第二节高糖状态对人牙龈上皮细胞中TLR-2、4及炎症因子的表达影响1.研究目的通过体外高糖状态下检测人牙龈上皮细胞TLR2、TLR4及相关炎症因子的表达,为进一步的体外功能研究奠定实验基础。2.研究方法按前述方法构建人牙龈上皮细胞体外培养体系,实验分组同前,分为正常组、高糖组和等渗组。收集各组细胞样本,Trizol法抽提细胞总RNA,实时荧光定量RT-PCR检测TLR2、TLR4、IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、NF-κB p65的转录水平,以β-actin为内参基因;采用流式细胞术检测各组TLR2、TLR4阳性细胞比例;收集细胞培养上清,采用ELISA方法定量检测各组细胞培养上清中IL-6、IL-8的蛋白水平。3.研究结果实时荧光定量PCR检测结果显示:牙龈上皮细胞TLR4分别在12h、24h时点各组间无显著性差异,但在48h时,高糖组TLR4mRNA水平(14.03±3.34)约为正常组(7.47±2.02)的2倍,两组间差异有统计学意义(P=0.022),等渗组与正常组间则无显著差异(P>0.05);而TLR2在三组牙龈上皮细胞中的mRNA表达无显著差异(P>0.05)。流式细胞术检测结果显示:与实时荧光定量PCR结果类似,高糖组牙龈上皮细胞中TLR4阳性细胞比例高于正常组和等渗组,差异有统计学意义(P<0.05);而牙龈上皮细胞中的TLR2阳性细胞比例在三组间无显著性差异(P>0.05)。对于炎症因子的检测,实时荧光定量RT-PCR结果表明:牙龈上皮细胞IL-6分别在12h、24h时各组间无显著性差异,但是在48h时,IL-6的mRNA水平在高糖组(5.82±1.84)约为正常组(2.88±0.77)表达的2倍,两组间差异有统计学意义(P=0.033);而等渗组与正常组间无显著差异(P>0.05);然而,牙龈上皮细胞IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、NF-κB p65的mRNA表达水平在各组、各时点均未出现显著性改变(P>0.05)。ELISA检测结果显示:牙龈上皮细胞上清液中的IL-8在各组、各时点均未出现显著性改变(P>0.05);由于各组细胞培养上清中IL-6浓度峰值较低,ELISA方法检测到各组细胞上清中IL-6的表达水平处于试剂盒检测范围下限,故未作统计比较。4.结论高糖状态下TLR4、IL-6在人牙龈上皮细胞中表达上调,而TLR2、IL-1β IL-8、TNF-α、MCP-1、NF-κB p65的表达无显著影响,提示高糖在一定程度上影响了牙龈上皮细胞的炎性分泌机制。第三章TLR4在高糖状态下牙龈上皮细胞炎症反应中的作用研究1.研究目的通过体外阻断TLR4在牙龈上皮细胞中的表达,检测TLR4在高糖以及LPS刺激时对细胞炎性反应中的表达变化,以期探讨TLR4在糖尿病机体内牙周局部组织防御中的可能作用。2.研究方法按前述方法,建立人牙龈上皮细胞体外培养体系。正常组和高糖组人牙龈上皮细胞分别培养48h后,分别以浓度为0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的LPS加入至两组培养基中,在2h、4h和8h时,荧光定量RT-PCR检测前炎症因子(IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1)的转录水平,ELISA检测细胞培养上清液中IL-6和IL-8的表达水平。正常组和高糖组人牙龈上皮细胞分别培养48h后,分别分为4个处理组:空白、LPS(1μg/ml)、TAK-242(1μM)、LPS+TAK-242。其中TAK-242处理组和LPS+TAK-242处理组预加入TAK-242处理1h后,再予LPS和LPS+TAK-242处理组分别加1μg/ml的LPS刺激,8h后荧光定量RT-PCR检测相应炎症因子(IL-6、IL-8、MCP-1)的mRNA水平,ELISA检测细胞培养上清液中IL-6和IL-8的表达水平及Westerblot检测NF-κB的蛋白水平。3.研究结果实时荧光定量PCR检测结果显示:LPS刺激上调了人牙龈上皮细胞IL-1β、 IL-6、IL-8、MCP-1的mRNA水平,高糖可进一步促进LPS诱导的IL-1β、IL-6、 IL-8、MCP-1mRNA水平高表达;TLR4拮抗剂TAK-242有效阻断了高糖和LPS诱导人牙龈上皮细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、NF-κB的表达上升。ELISA检测结果显示:LPS可促进人牙龈上皮细胞上清液中IL-8的表达,高糖可进一步增加LPS诱导的细胞上清液中IL-8高表达;TAK-242可有效阻断高糖和LPS诱导人牙龈上皮细胞上清液中IL-8的分泌表达。4.结论高糖以及LPS诱导下牙龈上皮细胞的炎性分泌显著增加,而TLR4在此过程中发挥关键作用,提示TLR4相关信号通路在糖尿病性牙周炎的发生发展可能发挥重要作用。