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研究背景生物体在从器官、组织到细胞等各个层次上的生命活动均离不开一定的力学环境。作为生命基本组成单元的细胞,其生存的力学环境非常复杂。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝脏分泌细胞外基质的主要细胞,在肝纤维化的发病机制中占有重要的地位。如何控制HSC的活性从而逆转肝纤维化的进程是抗肝纤维化研究的重点之一。慢性肝炎往往伴随着门脉高压症,高门脉压力会使肝窦扩张,HSC受到的牵张力增大。国内外对机械牵张对HSC生物性状的影响的研究甚少。本研究通过应用程序化细胞牵拉装置Flexercell Strain Unit 2000,对体外培养的HSC施与循环机械牵拉造成周期性张应变,并研究其对HSC生物学活性的影响,探讨张应变在HSC活化、增殖、生成ECM等功能改变中所起的作用及其作用机制。方法采用酶消化—密度梯度离心法分离大鼠HSC。实验分为对照Control组(Con)、单纯牵拉Stretch组(MS)、牵拉+ cRGDfV (AM100)组(AM)、牵拉+SB202190组(SB)、牵拉+wortmannin组(wort)、牵拉+ PD98059组(PD)共六组。细胞培养于BioFlex六孔板,生长至合适密度后,换成含1% FBS的DMEM培养液同步化24小时,含抑制剂的四组细胞用含相应工作浓度的抑制剂工作液处理,对照组与单纯牵拉组细胞用含0.5‰DMSO和1% BSA的DMEM培养液处理;1小时后给除对照组外的其他组细胞施加周期性张应变(牵拉条件为10%幅度,0.5 Hz频率,24 h时间)。牵拉完毕后检测细胞的增殖、迁移等功能,提取总RNA行PCR检测各种细胞活化相关因子的基因表达,提取总蛋白行western blot检测多种信号蛋白表达。实验重复三次。数据用均数±标准差表示,应用SPSS 18.0软件进行统计学分析,方法采用单因素方差分析,显著性P<0.05认为总体差异有统计学意义,多重比较选用Tukey检验。结果一、HSC的分离与鉴定:应用密度梯度离心法成功分离出静止期大鼠HSC,台盼蓝染色鉴定HSC存活率95%以上; Desmin、α-SMA免疫荧光鉴定静止与活化HSC细胞纯度达95%以上。细胞正常培养5-7天左右自行活化,生长繁殖明显增强,传代培养5次后生长繁殖能力下降。二、不同牵拉条件对HSC的影响当牵拉参数设置为10%幅度、0.5 Hz频率、24小时的时候,牵拉组HSC的胶原基因生成不仅比对照组显著增加,也是各种条件中差异比较明显而稳定的一个状态。故后续实验中均使用10%幅度、0.5赫兹、24小时的牵拉条件。三、周期性张应变对HSC生物活性的影响周期性张应变能显著促进HSC增殖,给予整合素αvβ3抑制剂cRGDfV能够抑制周期性张应变的促增殖效应。周期性张应变明显促进了HSC的α-SMA的表达,同时也促进TGF-beta 1与CTGF等促纤维化因子的表达,提示周期性张应变促进HSC的增殖与活化,是部分通过促进TGF-β1与CTGF表达实现的。另外本实验未能检测到周期性张应变影响PDGF-B及其受体PDGFR-B表达,提示周期性张应变的促增殖活化作用与PDGF-B通路无关。周期性张应变能够显著促进HSC的I型胶原α1链(COL1A1)和III型胶原α1链(COL3A1)的mRNA表达,其中以COL3A1更为明显;该作用能够被cRGDfV所抑制。通过划痕与Transwell实验发现,周期性张应变单独作用对HSC的迁移影响不明显,但是能够增强PDGF所诱导的HSC迁移。而通过抑制αvβ3整合素的活化,周期性张应变的促增殖、活化与迁移影响明显减弱。综合前述结果,本部分研究发现提示在肝纤维化发生发展过程中,一方面直接通过整合素途径,促进TGF-beta、CTGF等促纤维化因子,促使HSC的增殖活化,从而直接参与了肝纤维化的发生;另一方面,通过激活整合素途径,协同细胞因子PDGF增强HSC的迁移能力,加快肝纤维化的进展。肝硬化门脉高压症引起HSC受到的张应变增加,而张应变通过促进HSC的纤维生成作用而反馈加重门脉高压,提示张应变对门脉高压症状的维持和发展可能起到一定的作用。四、周期性张应变调节HSC功能的机制研究结果说明周期性张应变能够明显增强整合素β3、p38、Akt、ERK1/2的磷酸化。cRGDfV不能抑制HSC的整合素β3亚基磷酸化,但能抑制细胞内粘附斑激酶FAK的磷酸化水平。Akt、p38、ERK1/2磷酸化抑制剂wortmannin、SB202190、PD98059分别能够明显降低HSC相应蛋白磷酸化水平。周期性张应变能够明显增强HSC增殖蛋白PCNA的表达,并促进α-SMA、COL1A1和COL3A1的基因表达;应用cRGDfV或能够明显抑制张应变的这些促增殖活化效应;而应用SB202190,Wortmannin ,PD98059能够部分抑制张应变的这些效应。这些结果提示周期性张应变对HSC的影响是通过激活整合素αvβ3,活化FAK这条信号转导途径实现的;而αvβ3,FAK之后的通路可能与MAPK和Akt通路相关。结论1、成功在体外分离出大鼠静止HSC,分离出的静止HSC能够传代培养多次并在培养过程中自行活化。2、周期性张应变能明显促进HSC的I型胶原α1链的基因表达,特别是在牵拉幅度为10%,牵拉频率为0.5 Hz,牵拉时间为24小时的牵拉条件下促进效果最显著。3、周期性张应变能明显促进HSC的增殖和活化,并促进了PDGF-BB介导下的HSC迁移,提示张应变能够增强HSC的促纤维化效应。4、周期性张应变能促进HSC胞膜上的整合素αvβ3的表达和活化,致FAK磷酸化,激活MAPK、Akt等信号转导通路,导致后续生物学效应。提示整合素αvβ3是周期性张应变作用于HSC的重要信号分子。