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第一、二部分pp-GalNAc- Ts在人恶性造血细胞株中mRNA的表达差异及与白血病细胞诱导分化的相关性研究目的:从mRNA水平检测K562细胞株、SHI-1细胞株中多肽:N乙酰氨基半乳糖转移酶家族(pp-GalNAc-Ts)的表达情况。选择其中高表达的pp-GalNAc-T亚型作为研究对象,RT-PCR测定它们在不同浓度的1,25(OH)2 D3处理后K562和SHI-1细胞中的表达变化,同时进行细胞形态学观察以及细胞周期和凋亡的检测来证实1,25(OH)2 D3诱导的K562和SHI-1的分化。方法:1.采用RT-PCR方法检测:(1)多肽:N乙酰氨基半乳糖转移酶家族在K562细胞株、SHI-1细胞株中的mRNA表达;(2)分化诱导剂处理后K562细胞株和SHI-1细胞ppGalNAcTs的mRNA表达差异。2.用瑞氏染色细胞后,光学显微镜下观察细胞形态变化。3.流式细胞仪检测加分化诱导剂处理后细胞周期和凋亡情况。结果:1.在K562细胞,只有pp-GalNAc-T2, -T4, -T5和-T7有明显表达,且表达量高低顺序为2> 4 > 7 > 5,而其他的pp-GalNAc-T表达很低或者几乎不表达。在SHI-1细胞,pp-GalNAcT-1, -T2, -T3和-T4表达明显,其中,pp-GalNAc-T4表达最高,其他三个表达几乎相等。2.1,25(OH)2D3可诱导K562和SHI-1细胞向单核细胞系分化,表现为核染色质浓缩聚集和胞浆空泡增加。且具有剂量依赖性。并以SHI-1变化更为显著。3.在经过不同浓度的1,25(OH)2D3处理之后,未出现细胞凋亡;也未出现亚G1期细胞,即凋亡峰。这些结果说明,即使在高浓度1,25(O)2D3的水平(10-6 mol/L),也不影响K562和SHI-1细胞的凋亡。4.10-8, 10-7, 10-6 mol/L 1,25(OH)2D3处理K562细胞72 h后,pp-GalNAc-T2, -T4, -T5, -T7表达量均增加,并表现出明显的剂量依赖性模式(pp-GalNAc-T2在低浓度10-8 mol/L 1,25(OH)2D3诱导下没有明显增加)。其中,pp-GalNAc-T4的表达明显上调(所有浓度处理组与对照组相比,p<0.01)。pp-GalNAc-T5的表达上调也较明显(中、高浓度处理组与对照组相比,p<0.01)。5.在不同浓度1,25(OH)2D3处理之后,SHI-1细胞中各型pp-GalNAc-Ts表达量的变化情况与K562细胞存在明显差异。pp-GalNAc-T1,在低浓度,10-8 mol/L 1,25(OH)2D3诱导下没有表达变化;在中浓度,10-7 mol/L 1,25(OH)2D3诱导下其表达量上调一倍(与低浓度处理组相比p<0.01);在高浓度,10-6 mol/L 1,25(OH)2D3诱导下其表达量上调接近十倍(与中浓度处理组相比p<0.001)。pp-GalNAc-T2,在低浓度,10-8 mol/L 1,25(OH)2D3诱导下其表达量上调至对照组表达量的178%(p<0.05);在中浓度,10-7 mol/L 1,25(OH)2D3诱导下其表达量持续上调至对照组表达量的230%(p<0.05);但在高浓度,10-6 mol/L 1,25(OH)2D3诱导下其表达量转而下降。而pp-GalNAc-T3的表达量在经不同浓度1,25(OH)2D3处理后均无明显改变。pp-GalNAc-T4表达量变化刚好跟TI和T2的结果相反,以一种剂量依赖性方式下调(中、高浓度处理组与对照组相比p<0.01)。结论:本实验中ppGalNAc-Ts在不同白血病细胞株中表达情况不一致,推测不同的ppGalNAc-Ts其多肽底物特异性不同。pp-GalNAc-T2对白血病细胞的分化具有专一的正相关。这是O-糖链合成的起始酶影响白血病细胞株生长、分化的首次报道,以上这些结果都提示了,细胞中糖基转移酶和表面糖链结构的变化可以改变细胞的命运,同时也提出了糖链还具有以往所不知道的新功能。第三、四部分pp-GalNAc-T4正义表达载体的构建及上调pp-GalNAc-T4对白血病细胞分化的影响及机制探讨目的:研究pp-GalNAc-T4在全反式维甲酸诱导的白血病细胞分化中的作用,以及机制的探讨。方法:1,我们构建了pp-GalNAc-T4的正义表达载体,上调白血病细胞NB4中内源性pp-GalNAc-T4的表达.,2,用激光共聚焦显微镜观察细胞形态的变化,3,通过NBT还原实验观察白血病细胞是否向成熟方向分化。4,通过实时PCR,检测了用全反式维甲酸处理NB4-T4稳转细胞株后,其细胞内的癌蛋白PML-RARα基因表达情况。结果:1.首次构建了针对pp-GalNAc-T4的载体; 2.首次研究发现了在pp-GalNAc-T4cDNA转染NB4细胞株后,pp-GalNAc-T4基因的表达增加,观察白血病细胞的形态变化,发现上调pp-GalNAc-T4基因表达后,NB4 -T4细胞组加入ATRA后,细胞核和细胞质没有明显的变化,这说明上调表达pp-GalNAc-T4,并不能促进ATRA诱导NB4细胞的分化,反而抑制了ATRA诱导的NB4细胞分化;3.上调pp-GalNAc-T4基因表达后,用不同浓度的ATRA作用各细胞组72小时后,不能增加NB4-T4细胞的还原能力(P>0.05),但是可以增加NB4和NB4-0细胞的还原能力(P<0.01)。这说明上调表达pp-GalNAc-T4,抑制了ATRA诱导的NB4细胞的NBT还原能力。pp-GalNAc-T4抑制全反式维甲酸诱导的NB4细胞的分化,而这种作用可能和癌蛋白PML-RARα有关;4.我们对标准型CD44s和变异型v6的RT-PCR结果显示ppGalNAcT4的高表达并不影响CD44s和CD44v6mRNA水平的表达,但这并不能完全排除ppGalNAcT4的这种作用与CD44相关的可能性。可能的情况是:ppGalNAcT4直接修饰CD44,改变了其分子表面的糖链结构从而影响了CD44与透明质酸的结合;从而使得CD44不能与抗体结合,就不能降解PML-RARα蛋白(M3),从而抑制了NB4细胞的分化。结论:上调表达pp-GalNAc-T4,抑制全反式维甲酸诱导的NB4细胞的分化,而这种作用可能和癌蛋白PML-RARα有关。pp-GalNAc-T4抑制全反式维甲酸诱导的NB4细胞的分化,而这种作用可能和癌蛋白PML-RARα有关。可能的作用机制是:ppGalNAcT4直接修饰CD44,改变了其分子表面的糖链结构从而影响了CD44 ,使得CD44不能与抗体结合,就不能降解PML-RARα蛋白(M3),从而抑制了NB4细胞的分化。