论文部分内容阅读
[目的]基因芯片检测鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci,Cps）急性感染与持续性感染的差异表达基因,筛选与Cps 6BC持续性感染有关的关键基因,探讨Cps持续性感染发生的可能分子机制。[方法]1.Cps 6BC诱导细胞的急性感染:用Cps 6BC标准株感染He La细胞,培养2h后从培养箱中取出,吸弃感染液,更换为DMEM+10%FBS,37℃培养。2.Cps 6BC诱导细胞的持续性感染:用Cps 6BC标准株感染He La细胞,并在感染液中加入35ng/m L rh IFN-γ,培养2h后从培养箱中取出,吸弃感染液,更换为含35ng/m L rh IFN-γ的衣原体生长培养基,37℃培养。3.分别收集6、12、24、36、48、60h Cps 6BC急性感染与持续性感染的He La细胞,提取Cps RNA后,采用Agilent 8×15K Cps全基因组表达谱芯片检测、比较分析急性感染与持续性感染中Cps的差异表达基因,然后用Absolute Fold change≥2为显著上调,Fold change≤0.5为显著下调,同时Flag标记为Detected的标准进行差异基因筛选,运用GO分类、KEGG代谢通路及DAVID在线软件对差异基因进行功能聚类及通路分析,并通过Realtime-PCR确证部分差异基因。[结果]通过比较Cps急性感染与持续性感染,发现在1260h共有持续性感染差异表达基因287个,包括74个表达上调基因,以及213个表达下调基因,GO分类的BP分析显示,21个持续性感染表达上调基因参与1个与翻译相关的BP分类“translation”,EASE score为3.58E-09,58个持续性感染表达下调基因参与8个BP分类,其中能量代谢相关的“oxidation reduction”、参与氨基酸合成及代谢的“tetrapyrrole biosynthetic process”、“tetrapyrrole metabolic process”EASE Score最低,小于0.03。57个持续性感染表达上调基因参与4个MF分类,“structural molecule activity”、“structure constituent of ribosome”、“r RNA binding”ESAE Score较低,小于9.6E-6。41个持续性感染表达下调基因参与8个MF分类,主要涉及核苷酸及无机离子转运等,其中“nucleotidyl transferase activity”、“sodium ion binding”、“oxidoreductase activity”的EASE Score最低,小于0.03。利用KEGG pathway分析显示,当EASE Score<0.1时,有18个持续性感染表达上调基因参与了1条“KEGG-pathway”;38个持续性感染表达下调基因参与了5条“KEGG-pathway”。将持续性感染差异表达基因涉及的生物学功能进行“Functional Annotation Clustering”分析,结果显示持续性感染表达上调基因涉及的生物学功能分类聚成4个集合,其中Enrichment Score最高的功能集合与r RNA的合成相关。持续性感染表达下调基因涉及的生物学功能分类聚成23个集合,其中Enrichment Score最高的功能集合与某些生物合成及代谢相关。Real time-PCR检测目的基因CPSIT0739（6h）、CPSIT0043（12h）、CPSIT0531（36h）、CPSIT0555（48h）的m RNA表达水平,结果均与芯片结果相同。[结论]1.构建了Cps急性感染与持续性感染差异基因表达谱;2.通过Agilent Cps全基因组表达谱芯片共筛选出1260h持续性感染差异表达基因287个,其中表达上调基因74个,表达下调基因213个,结合其他人工构建体外持续性感染模型,这些基因可能成为持续性感染标志性基因。