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目的:安罗替尼是一种口服的新型小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂,具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的双重作用。2018年5月,安罗替尼获国家药品监督管理局批准上市,用于治疗晚期或转移性非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)。该III期临床研究(ALTER 0303,NCT02388919)结果于2018年11月发表于JAMA Oncology期刊上。本课题组通过整理ALTER 0303临床研究不良事件资料发现,安罗替尼在延长NSCLC患者生存期的同时也产生了高甘油三酯血症、高胆固醇血症等血脂代谢异常。安罗替尼组高甘油三酯血症及高胆固醇血症发生率分别为44.56%和41.84%,与安慰剂组比较均具有统计学差异,提示安罗替尼作用于抑癌靶点及通路的同时,也影响着脂质代谢的作用靶点及通路。因此,本课题旨在进一步研究高脂血症不良事件与NSCLC患者生存期之间的关系,明确安罗替尼对脂质代谢的调节作用,并初步探索可能的机制,为深入阐述安罗替尼作用机理提供实验依据。方法:1.采用常见不良事件评价标准(CTCAE 4.03)对高脂血症不良事件进行评价及分级。观察及分析安罗替尼组和安慰剂组高脂血症不良反应的发生情况,并进行χ2检验。采用Kaplan-Meier曲线对安罗替尼组患者进行生存分析,以明确高脂血症不良事件与安罗替尼疗效之间的关系。2.采用油红O染色法和Western blot方法,分别检测3T3-L1细胞内脂滴沉积和过氧化物酶体增殖激活物受体γ(peroxisome prolife-rator-activated receptorγ,PPARγ)蛋白表达水平。采用RT-q PCR法检测3T3-L1细胞内PPARγ和CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteinα,C/EBPα)m RNA表达量。3.C57BL/6J小鼠随机分为三组,即生理盐水组(对照组)、安罗替尼(实验组)(3mg/kg)、雷帕霉素(阳性对照组)(2mg/kg)。对各组小鼠进行灌胃给药,每天一次,共21天。在给药期间,定期测量和记录小鼠的体重和摄食变化,并且观察、记录小鼠生命体征。给药结束后,测量各组小鼠血清中甘油三酯(triacylglycerol,TG)、胆固醇(totalcholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)含量。解剖小鼠,观察各组小鼠脏器变化,计算肝脏系数,采用HE染色观察肝脏和脂肪组织形态。提取小鼠肝脏总蛋白以及总RNA,采用Western blot法检测肝脏内胆固醇合成关键酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(hydroxy-methylglutaryl Co A reductase,HMGCR)、脂肪酸(fatty acid,FA)合成关键转录因子固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBP1)、LDL受体(LDL receptor,LDLR)、AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)、p-m TOR蛋白表达水平,采用RT-q PCR法检测肝脏内HMGCR、AMPK、m TOR、SREBP1、SREBP2、LDLR、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylase,ACC)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)、硬脂酰Co A去饱和酶1(Stearoyl Co A desaturase 1,SCD1)m RNA的表达量。结果:1.我们对294例安罗替尼组和143例安慰剂组出现高甘油三酯血症和高胆固醇血症的发生率进行χ2检验,结果表明,安罗替尼组高脂血症的发生率明显大于安慰剂组,且差异具有统计学意义。同时我们统计的277例安罗替尼组患者的无进展生存期(Progression free survival,PFS)和总生存期(Overall survival,OS)结果显示,未发生高脂血症不良反应与发生高脂血症不良反应的患者的PFS分别为131天和195天,而OS则分别是239天和378天,经Kaplan-Meier曲线统计分析,结果显示发生高脂血症不良反应患者的PFS和OS与血脂正常病人相比均显著延长。2.油红O染色实验结果表明,安罗替尼对3T3-L1细胞的内脂滴的沉积无明显抑制作用。Western blot实验结果表明,安罗替尼不能抑制3T3-L1细胞内PPARγ蛋白表达水平。RT-q PCR实验结果表明,安罗替尼不能抑制细胞内PPARγ、C/EBPα转录因子m RNA表达量。3.C57BL/6J小鼠实验结果表明,与对照组相比,安罗替尼组小鼠体重、摄食及生命体征均无明显变化。而雷帕霉素组小鼠体重显著减少,而且摄食也有减少的趋势,但生命体征无明显变化。小鼠血清检测结果显示,与对照组相比,安罗替尼和雷帕霉素组小鼠血清中TC和LDL-C含量均显著升高,TG含量也有升高的趋势,而HDL-C含量无明显变化。与对照组相比,安罗替尼和雷帕霉素组小鼠的肝重系数明显升高。HE染色实验结果表明,安罗替尼组和雷帕霉素组小鼠肝脏内空泡增多,安罗替尼组小鼠脂肪组织细胞形态无明显变化,而雷帕霉素组脂肪组织细胞显著变小。Western blot实验结果表明,与对照组相比,安罗替尼组和雷帕霉素组SREBP1蛋白表达水平显著增加,而LDLR、p AMPKα、pm TOR蛋白表达水平明显降低,HMGCR、AMPKα和m TOR总蛋白的表达水平未见明显变化。RT-q PCR实验结果表明,与对照组相比,安罗替尼组HMGCR m RNA表达量明显升高,ACC、SCD1、FASN m RNA表达量有增加的趋势,但差异无统计学意义,而LDLR、AMPKαm RNA表达量明显降低,m TOR、SREBP1、SREBP2 m RNA表达量无明显变化。与对照组相比,雷帕霉素组HMGCR、ACC、FASN m RNA表达量显著增加,SREBP1、SREBP2、SCD1 m RNA表达量有增加的趋势,但差异无统计学意义,而AMPKα、LDLR m RNA表达量显著降低,m TOR m RNA表达量没有明显变化。结论:1.安罗替尼组患者高脂血症不良事件发生率显著高于安慰剂组,提示安罗替尼在发挥抗肿瘤作用的同时,可能也影响着患者脂质代谢过程。与不发生高脂血症不良事件患者相比,安罗替尼组发生高脂血症不良事件患者PFS和OS均显著延长,提示高脂血症有可能成为安罗替尼疗效预测指标之一。2.安罗替尼对3T3-L1细胞内脂滴沉积和分化关键转录因子的表达都无明显影响,表明安罗替尼对3T3-L1细胞分化无明显作用。安罗替尼可能不是通过促进脂肪前体细胞分化的途径,影响机体脂质代谢。3.安罗替尼导致小鼠血清TC、LDL-C含量明显升高。安罗替尼可下调肝脏LDLR表达,减少LDL-C摄取。同时,安罗替尼还可能通过抑制AMPK磷酸化,上调HMGCR表达。安罗替尼可能通过以上双重作用导致高胆固醇血症。另一方面,安罗替尼可能通过抑制AMPK磷酸化,增强转录因子SREBP1表达,从而促进肝脏中FA合成。另外,安罗替尼还可能通过抑制肝脏m TOR磷酸化调节下游脂质代谢相关通路,从而影响脂质代谢。