l-薄荷醇是全球三大香料化学品之一，广泛用于医药、食品、烟草、化妆品及口腔保健等产品，年产量超过2万吨，价值高达5亿美元。由于受天气、地域的影响及全球经济的迅速发展，天然薄荷醇已经无法满足需求，因此化学合成方法称为解决这一问题的有效途径。但化学合成所得的产物是8个薄荷醇异构体的混合物（4对薄荷醇），需要通过拆分来制备l-薄荷醇。脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是广泛存在于自然界生物体中的水解酶，其中来源于微生物的脂肪酶被广泛应用于医药、精细化工、食品、造纸、纺织以及皮革加工等工业领域。在催化特性上，微生物脂肪酶能够催化水解反应及其逆过程，并且具有稳定性高、选择性好以及不需要辅酶等优点，因此得到愈来愈多的研究与应用。虽然产脂肪酶的微生物比较容易发现，但获得满足工业应用要求的优良脂肪酶产生菌却存在一定困难。　　本文以酶促拆分制备l-薄荷醇为目标，筛选获得了能够耐受有机溶剂并具有较高立体选择性的脂肪酶。其中嗜麦芽糖寡养单胞菌脂肪酶，能够特异性地催化L薄荷醇与乙酸乙烯酯发生转酯化，并且在常见有机溶剂中保持较高稳定性，因此能够实现在工业条件下对4对薄荷醇混合物来拆分制备高纯l-薄荷醇的目的。论文的主要工作包括以下五个部分:　　第一，非水相中立体选择性拆分l-薄荷醇脂肪酶的筛选。构建双液相荧光筛选体系，能够快速定量地筛选来源于OSS微生物的OST脂肪酶，这一方法拓宽了OST脂肪酶的微生物来源。以橄榄油为唯一碳源，从土壤中筛选得到4328个产脂肪酶的微生物，然后通过高通量筛选方法从中复筛得到21个不同种属来源的耐有机溶剂脂肪酶，其中10个脂肪酶来源于OSS微生物。通过对这些脂肪酶在甲苯中拆分4对薄荷醇结果的考察，获得一个能够高立体选择性催化薄荷醇转酯化的脂肪酶——嗜麦芽糖寡养单胞菌（保藏号CGMCC No.4254）脂肪酶。　　第二，嗜麦芽糖寡养单胞菌的产酶过程以及脂肪酶（简写SML）的催化特性的研究。嗜麦芽糖寡养单胞菌脂肪酶目前未见详细的研究报道，因此研究首先优化了培养基组成以及发酵条件，转酯化拆分4对薄荷醇的单位发酵液酶活为62.3U/L，较优化前的产酶量提高了10倍。然后通过纯化步骤，获得了电泳纯的脂肪酶样品（比活力38.9U/mg）。SML对中、长链脂肪酸酯底物的水解活力较高，在5℃下保持最大活力的57％，在高于40℃条件下不稳定，在5-35℃范围内的反应活化能Ea=3.25kcal/mol，属于低温脂肪酶。该酶在50％和100％(v/v)疏水性有机溶剂中保存7天后，依然能够保持全部酶活力。采用纯化的SML催化100 mM的4对薄荷醇与乙酸乙烯酯发生立体选择性转酯化，转化率达到95.9％，产物e.e.p=98.4％，d.e.p=86.9％。　　第三，脂肪酶基因的克隆、高效异源表达以及氨基酸特异保守型的研究。通过构建及筛选含有6.2万个克隆子的全基因组文库，成功克隆得到全长为1521bp的脂肪酶基因（简写为LipSM54）。根据进化树分析、保守序列比对以及新氧离子洞催化机理的研究，提出LipSM54与同源性较高的12个假设脂肪酶都属于一个新的细菌脂肪酶家族——LipSM54细菌脂肪酶家族。重组大肠杆菌表达的脂肪酶水解活力优化后达到4235U/L，转酯化拆分活力达到203U/L，较野生菌发酵酶活提高了3.3倍。　　第四，提高脂肪酶热稳定的蛋白质结构设计与改造。在远离脂肪酶活性中心的区域引入一个盐桥，导致脂肪酶高柔性区域内的氢键数目增加，来提高脂肪酶稳定性。通过蛋白质结构模拟与虚拟筛选的手段，以增加脂肪酶高柔性区域中氢键数量为目标，计算出影响脂肪酶热稳定性的关键位点信息，其中双突变脂肪酶F73R-G165D，在50℃下半衰期相比原始脂肪酶提高了924倍，催化水解反应的最适温度由35℃提高到90℃;在50％(v/v)极性溶剂中的稳定性显著提高。通过分子动力学与热力学研究发现，脂肪酶突变后形成的盐桥73R-165D，导致蛋白质结构变化，进一步新生成的6个氢键与盐桥共同增强了脂肪酶结构刚性。　　第五，重组脂肪酶在非水相中拆分高底物浓度4对薄荷醇混合物的过程研究。LipSM54拆分4对薄荷醇中个工艺参数的优化:正己烷为反应溶剂，乙酸乙烯酯作为酰基供体，乙酸乙烯酯与l-薄荷醇摩尔浓度比例为2∶1，反应温度为35℃。在10％(w/v)底物浓度条件下，转化24小时后LipSM54催化所得产物的e.e.p＞99.5％，d.e.p=90.4％。研究进一步评价了1L反应体系条件下的拆分过程，转化24小时后，获得了132mM光学纯度为90％的l-薄荷醇乙酸酯，时空产率达到1.1 g/L/h，相比同类工艺，转化效率相当的条件下，产物的光学纯度更高。