莲子在医疗或食疗中常被用于治疗腹泻、组织炎症、心律失常、癌症、利尿剂和皮肤疾病,还可作为解毒剂和保肝成分。近年来,莲子潜在的营养和功能特性被逐渐挖掘,在功能性食品、化妆品、药品等方面均已显示出了良好的应用价值。目前国内外关于低聚糖对肠道微生态学影响研究主要集中于几种常见的低聚糖作为潜在益生元上,而对于莲子低聚糖对肠道微生态影响的研究尚属空白领域。本课题组前期研究成果已表明,莲子低聚糖(LOS)、多糖和淀粉对青春双歧杆菌都具有良好的增殖效应,但具体作用机理尚未阐明。因此,本研究继续以莲子低聚糖作为研究对象,系统性地研究莲子低聚糖快速提取、分离工艺及各组分单体的具体结构,以及对小鼠肠道菌群的调节机制。通过体外试验分别研究莲子低聚糖各单体对益生菌的增菌和抑制致病性大肠杆菌粘附人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2细胞)的效果,选用效果较好的单体进一步研究其对青春双歧杆菌和致病性大肠杆菌的具体作用位点。研究结果表明：(1)响应面法优化超声波-微波组合辅助提取莲子低聚糖工艺的研究采用响应面法对莲子低聚糖的超声波-微波辅助提取工艺进行优化。结果表明,莲子低聚糖最佳超声波微波辅助提取工艺条件为：提取时间325 s,液料比10 mL/g,超声波功率300 W,微波功率250 W,在此条件下,莲子总低聚糖、三糖和四糖的得率分别为10.998%、3.953%和4.891%,与理论预测值基本一致且无显著差异。比传统热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法提取得到的低聚糖得率分别提高了76.59%、17.47%和27.21%,时间分别缩短了12.18倍、8.92倍和1.16倍。(2)莲子低聚糖的快速分离制备工艺与结构研究采用制备色谱法分离制备莲子低聚糖,最佳制备工艺条件为：流速30 mL/min;进样量浓度0.2mL,进样体积1mL。在此条件下,共分离制备出4种莲子低聚糖化合物。通过薄层色谱法确定莲子低聚糖的最优展层流动相组成配比为：乙酸乙酯/无水乙醇/水/氨水(体积比为9：11：8：0.9)；高效液相色谱分析结果表明所制备出的四种低聚糖纯度较高,各化合物纯度分别为96.76%、98.07%、98.18%和99.74%；红外光谱分析结果表明：莲子低聚糖化合物2(LOS2)含有p-型糖苷键,化合物3-1(LOS3-1)、化合物3-2(LOS3-2)和化合物4(LOS4)含有甘露糖、呋喃糖、α-型糖苷键、α-D-吡喃葡萄糖特征的分子吸收峰。经MS测定可确定上述4种聚合度莲子低聚糖的分子质量分别为342、504、504和666 Da。单糖组分分析及核磁共振分析结果表明,α-型糖苷键与吡喃环为莲子低聚糖混合物的优势构象；所分离出的四种莲子低聚糖单体中,一种为乳糖,另外三种单体所对应的化学结构如下：化合物3-1为Man-α-1→6-Glu-α1→2-α-Fru,化合物3-2为Man-α-1→6-Man-α-1→6-Glu-α/β,化合物4为Man-α-1→6-Man-α-1→6-Glu-α-1→2-α-Fru,此外在莲子低聚糖提取液中还包含有甘露醇。(3)莲子低聚糖对小鼠肠道微生态环境调控作用研究以公认的益生元—低聚果糖(FOS)为阳性对照,研究莲子低聚糖对小鼠肠道菌群的调控作用。结果表明,莲子低聚糖能促进小鼠体重增长,同时对小鼠血常规指标无异常影响；通过收集不同喂养时期的小鼠粪便与小鼠肠道内容物经变性梯度凝胶电泳(DGG E)分析以确定小鼠肠道及粪便中的优势菌落的构成。其中,中剂量的莲子低聚糖能有效改变小鼠肠道及粪便中的菌落构成,高剂量莲子低聚糖与低聚果糖灌胃的小鼠在粪便菌落构成上有着相似的效果；通过荧光定量PCR技术测定小鼠粪便中细菌数量的相对变化可知,莲子低聚糖能显著提高小鼠粪便中双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、丁酸弧菌属数量,同时降低梭菌及肠杆菌数量,促进小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸含量的显著提高(p<0.05)。(4)莲子低聚糖各单体对益生菌体外发酵特性的研究根据小鼠体内试验结果,由于莲子低聚糖对双歧杆菌和乳杆菌具有良好的增殖效果,因此进一步将莲子低聚糖各单体和益生菌菌株进行体外发酵试验。以不添加碳源的培养基作为空白对照,添加FOS为碳源的培养基作为阳性对照,研究莲子低聚糖各单体对益生菌菌株的单独作用。结果表明：短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧双歧杆菌能够有效利用葡萄糖(G1c)作为碳源,代谢产生乙酸、乳酸；嗜酸乳杆菌能够有效利用LOS3-1进行增殖,并代谢产生大量乙酸和乳酸；青春双歧杆菌、长双歧杆菌能够有效利用LOS4进行增殖,其代谢产生的乙酸、乳酸、丁酸显著高于其它碳源培养基(p<0.05)。(5)莲子低聚糖各单体对青春双歧杆菌作用历程的研究采用异硫氰酸荧光素(FITC)羟基标记法标记LOS3-1、LOS3-2 和LOS4,成功获得荧光低聚糖产物LOS3-1-FITC、LOS3-2-FITC和LOS4-FITC。紫外-可见吸收光谱扫描结果表明,LOS3-1-FITC、LOS3-2-FITC和LOS4-FITC的最大吸收波长为455 nm。荧光激发和发射光谱扫描结果表明,LOS3-1-FITC、LOS3-2-FITC和LOS4-FITC浓度达到0.012μmol/mL以上后,溶液荧光效应良好,其中最适荧光激发波长为490 nm,荧光最大发射波长为518 nm。基于益生菌体外发酵特性研究的试验结果,选用LOS4和青春双歧杆菌作为试验对象,进一步研究LOS4与青春双歧杆菌的作用位点。激光共聚焦显微镜观察结果表明,莲子低聚糖LOS4与青春双歧杆菌的作用位点位于菌体外部和内部,单一青春双歧杆菌菌体发酵LOS4的周期在1小时内即可完成。(6)莲子低聚糖各单体对抑制致病性大肠杆菌粘附Caco-2细胞能力的研究采用FITC作为荧光染料成功标记致病性大肠杆菌；Caco-2细胞经培养分化后具有刷状缘侧微绒毛,具备小肠上皮细胞的细胞极性,可模拟致病性大肠杆菌对小肠上皮细胞的粘附状态。致病性大肠杆菌在无外源性干扰的情况下会侵染正常生长的Caco-2细胞,并导致正常细胞凋亡,经外源碳水化合物干扰后,各化合物对抑制致病性大肠杆菌粘附Caco-2细胞效果分别为LOS4>甘露低聚糖(MOS)>甘露糖(Man)>LOS3-2>LOS3-1。糖与菌体发生粘附作用后,还能对细菌的细胞膜形态产生一定的影响,其中LOS4能够显著降低细胞膜的荧光各向异性值r,表明LOS4可能与致病性大肠杆菌表面受体具有较多的结合位点。LOS4能够显著抑制致病性大肠杆菌表面受体Fim与Lrp的mRNA表达,其中在抑制Lrp的表达效果与甘露低聚糖无显著差异(p>0.05)。激光共聚焦显微镜观察结果表明,莲子低聚糖LOS4与致病性大肠杆菌作用位点位于细菌细胞表面,12 h后LOS4开始在致病性大肠杆菌表面大量粘附并加速积累,其中结合位点多位于致病性大肠杆菌粘附面一侧,并未进入菌体内部被致病性大肠杆菌所利用。