肝癌通常指肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是全球第三大癌症相关死亡原因。HCC发生的主要原因包括肝炎病毒感染、化学致癌物、酒精以及肥胖相关代谢异常,这些因素可能引起慢性炎症和免疫抑制,最终导致HCC的发生。此外,基因多态性作为一种内在因素,可能通过影响个体的HCC易感性从而介导HCC的发生。因此,我们将HCC发生的主要机制归纳为炎症(inflammation)、代谢(metabolism)、免疫(immune)和基因多态性(polymorphism)等4个方面。细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P450 oxidoreductase,POR)是肝微粒体细胞色素P450酶(cytochrome P450 enzymes,CYPs)的唯一电子供体,具有高度多态性。文献报道不同的POR单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点的基因变异能够影响不同CYPs活性,可能因此具有疾病易感性,如POR基因多态性与乳腺癌和膀胱癌易感性有关,可能是由于影响了类固醇代谢相关CYPs活性。CYP第1、2、3家族属于药物代谢相关CYPs,主要介导临床药物、致癌物和前致癌物等外源性物质的代谢,与肝炎、肝硬化和肝癌等肝脏疾病关系密切。本课题组前期开展了CYPs与HCC关系的大量研究工作,发现并验证了高活性CYP2E1是HCC发生的风险因素。此外,我们分别分析了HCC患者多个POR SNP位点的突变杂合子和突变纯合子对CYPs活性的影响,填补了POR基因多态性在肝癌研究领域的空白。基于前期成果,我们进一步探究POR基因多态性与HCC易感性的关系,以及可能参与此过程的CYPs。目前关于基因多态性的研究多关注与疾病易感性的关系,而SNP位点的易感性机制缺乏更深入探讨。蛋白质是生命活动的基础,基因型的改变影响蛋白表型和蛋白相互作用,最终影响了机体生理功能和病理状态。随着蛋白质组学的快速发展,其与基因组学、转录组学等多组学联合策略被应用于探究从基因到蛋白各层面的关联和分子机制。因此蛋白质组学为探索易感性位点涉及的HCC发生机制提供了一种可靠易行的方法。本研究选取105例正常肝组织样本和102例HCC患者癌旁组织样本,考察POR基因多态性与HCC易感性的关系,并采用Label-free定量蛋白质组学方法探究POR易感性位点影响HCC发生的可能机制。本课题以期发现新的HCC易感性位点,并为POR基因多态性和HCC发生机制研究提供新策略和依据。1方法1.1人肝标本及临床资料收集收集105例正常肝组织标本和102例HCC患者癌旁肝组织标本,并纳入每个供体的性别、年龄、烟酒史和临床诊断等基本信息,以及丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyl transferase,GGT)、总蛋白(total protein,TP)和球蛋白(globulin,GLO)等临床指标。对于纳入研究的HCC患者,自切除术后进行随访,历时42~54个月。本研究的实验方案经过郑州大学伦理委员会批准,受试者均已签署知情同意书。1.2人肝微粒体制备采用差速离心法制备人肝微粒体。1.3肝微粒体蛋白浓度测定采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。1.4 CYP2E1活性测定以氯唑沙宗作为CYP2E1探针底物,代谢产物为6-羟基氯唑沙宗。100μL孵育体系包括肝微粒体蛋白、氯唑沙宗溶液和磷酸盐缓冲液。NADPH启动反应,冰水浴终止反应,乙酸乙酯萃取,氮气吹干,复溶后高效液相色谱仪测定。计算酶动力学参数:米氏常数(Michaelis-menten constant,Km)、最大反应速率(maximum velocity,Vmax)和清除率(intrinsic clearance,CLint)。1.5 POR基因多态性测定选取的4个POR位点rs10954732(G>A)、rs2286822(C>T)、rs1135612(A>G)和rs1057868(C>T)在中国人群中分布频率均大于1%。抽提人肝组织DNA,采用SNP Mass ARRAY方法进行基因分型检测。1.6 Label-free定量蛋白质组学方法鉴定肝组织蛋白组织提取全蛋白后酶切得到肽段溶液,小反向色谱柱法洗脱、收集组分,质谱检测。数据采用Max Quant软件搜库分析。采用归一化处理的基于峰面积的无标定量(intensity-based absolute protein quantification,i BAQ)值表示蛋白的表达水平。差异蛋白鉴定标准为表达差异倍数大于1.2倍且P<0.05。本研究从105例正常和102例癌旁肝组织中根据随机数表法分别抽取41和71例进行样品制备和质谱分析,根据数据质控标准,最终选取34例正常和61例癌旁肝组织的质谱数据进行差异蛋白鉴定、筛选和后续分析。1.7统计学分析本研究的统计分析采用SPSS 22软件,作图采用Graph Pad Prism 7软件。对符合正态分布数据采用参数检验,否则采用非参数检验。采用二元Logistic回归模型进行POR SNP位点与HCC易感性关联分析,矫正的混杂因素为年龄、性别、吸烟和饮酒。采用Kaplan-Meier方法对患者进行生存分析。ROC曲线分析描述预测价值。所有统计分析均采用双侧检验,P<0.05时有统计学意义。2结果2.1 POR基因多态性与HCC易感性关联分析2.1.1 POR基因多态性与HCC易感性POR位点rs10954732(G>A)中,与携带GG基因型人群相比,携带GA基因型人群患HCC的可能性降低(OR=0.30,95%CI:0.11~0.78,P=0.014),携带GA+AA基因型(发生基因变异)人群患HCC的可能性降低(OR=0.35,95%CI:0.14~0.88,P=0.026);G与A等位基因之间、GG与AA基因型之间以及GG+GA与AA基因型之间均未发现HCC易感性。结果提示,POR位点rs10954732基因变异可能减少HCC的发生风险。POR位点rs2286822、rs1135612和rs1057868的基因多态性与HCC发生风险无明显关系。2.1.2 POR位点rs10954732基因多态性与临床血液指标在HCC组中,基因变异人群的ALT和AST水平降低(P=0.027;P=0.005),提示POR位点rs10954732基因变异可能一定程度改善肝功能;正常人群ALT和AST的表达水平与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。2.1.3 POR位点rs10954732基因多态性与CYP2E1活性在HCC组中,基因变异人群的V2E1和CL2E1降低(P=0.038;P=0.017),提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与CYP2E1活性降低有关;正常人群CYP2E1活性与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。2.2 POR位点rs10954732的HCC易感性蛋白质组学研究2.2.1差异蛋白鉴定鉴定到34例正常和61例癌旁组织的差异蛋白共1360个,根据差异显著程度,P<0.01、0.01≤P<0.03和0.03≤P<0.05的差异蛋白数量分别为640、425和295个。与正常组相比,HCC组中包含上调蛋白814个和下调蛋白546个。将HCC组分为GG和GA+AA亚组鉴定差异蛋白,其中GG亚组16例,GA+AA亚组44例,剔除1例未检测到基因型的样本。共鉴定到亚组差异蛋白345个,根据差异显著程度,P<0.01、0.01≤P<0.03和0.03≤P<0.05的差异蛋白数量分别为80、144和121个。与GG亚组相比,GA+AA亚组中包含上调蛋白315个和下调蛋白30个。2.2.2亚组差异蛋白基因本体(GO)分析对亚组的345个差异蛋白从细胞组分、分子功能和生物过程等3个层面进行GO分析。细胞组分层面,亚组差异蛋白主要位于细胞器内膜、内质网腔、胞质核糖体、锚定连接和溶酶体等部位;分子功能层面,亚组差异蛋白主要涉及氧化还原酶活性、核糖体结构组成、细胞粘附分子结合、葡糖基转移酶活性、用于CH-OH基团的氧化还原酶活性、涉及异型细胞-细胞粘附的蛋白结合和电子传递活性等;生物过程层面,亚组差异蛋白主要参与蛋白质靶向输送、线粒体氧化呼吸链复合体装配、蛋白质折叠、细胞色素复合体装配、细胞蛋白分解代谢过程、内质网应激反应调控、一元羧酸代谢过程、T细胞介导的免疫和脂质分解代谢过程等。2.2.3候选差异蛋白的筛选及分析2.2.3.1差异蛋白的归类及筛选进一步,筛选可能与POR位点rs10954732基因变异保护作用有直接关联的蛋白。HCC组差异蛋白与基因变异亚组差异蛋白的交集蛋白共70个。根据GO、Gene Cards和NCBI Pub Med数据库将这些蛋白按照代谢、炎症、免疫、基因多态性和其他(others)等5类进行归类,每个蛋白可归属多类,共纳入了52个蛋白。其中,有11个蛋白参与代谢过程;25个蛋白参与炎症过程;20个蛋白参与免疫过程;8个蛋白的编码基因SNP位点具有癌症易感性;31个蛋白以非上述4个方面的机制参与癌症过程。52个蛋白在GA+AA亚组中均属于上调蛋白。从52个蛋白中筛选出同时满足在HCC组中为下调蛋白以及文献报道具有抑癌作用的候选蛋白共6个,分别为跨膜丝氨酸蛋白酶hepsin(serine protease hepsin,HPN)、柯萨奇病毒腺病毒受体(coxsackievirus and adenovirus receptor,CXADR)、短链脱氢酶/还原酶3(short-chain dehydrogenase/reductase 3,DHRS3)、Ras相关蛋白Rap2c(Rasrelated protein Rap-2c,RAP2C)、烯酰辅酶A水合酶1(enoyl-Co A hydratase 1,ECH1)和桥粒斑蛋白(desmoplakin,DSP)。2.2.3.2候选蛋白表达与临床指标HPN与正常组相比,HCC组HPN表达显著下调(P=1.00×10-6)。在HCC组中,基因变异人群HPN表达上调(P=0.014),提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与HPN表达增加有关;正常人群HPN的表达与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。将HCC组根据HPN表达分成低表达组和高表达组,高表达组AST和GGT的水平降低(P=0.008;P=0.006),ALT和GLO也呈现降低趋势(P=0.072;P=0.074),提示HPN可能一定程度改善肝功能。Kaplan-Meier生存分析显示,高表达组HCC患者的生存时间明显延长(Plog-rank=0.0057),提示HPN可能抑制HCC发展。ROC曲线下面积为0.792(P=3.00×10-6),提示HPN具有一定的HCC预测标志物价值。CXADR与正常组相比,HCC组CXADR表达下调(P=0.015)。在HCC组中,基因变异人群CXADR表达上调(P=0.011),提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与CXADR表达增加有关;正常人群CXADR表达与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。将HCC组根据CXADR表达分成低表达组和高表达组,高表达组CL2E1降低(P=0.043),V2E1也呈现降低趋势(P=0.100),提示CYP2E1活性降低可能与CXADR表达增加有关。ROC曲线下面积为0.650(P=0.016),提示CXADR具有一定的HCC预测标志物价值。DHRS3与正常组相比,HCC组DHRS3表达下调(P=0.0004)。在HCC组中,基因变异人群DHRS3表达上调(P=0.012),提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与DHRS3表达增加有关;正常人群DHRS3的表达与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。ROC曲线下面积为0.710(P=0.0007),提示DHRS3具有一定的HCC预测标志物价值。RAP2C与正常组相比,HCC组RAP2C表达下调(P=0.010)。在HCC组中,基因变异人群RAP2C表达上调(P=0.011),提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与RAP2C表达增加有关;正常人群RAP2C的表达与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。ROC曲线下面积为0.659(P=0.010),提示RAP2C具有一定的HCC预测标志物价值。ECH1与正常组相比,HCC组ECH1表达下调(P=0.011)。在HCC组中,基因变异人群ECH1表达上调(P=0.030),提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与ECH1表达增加有关;正常人群ECH1的表达与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。ROC曲线下面积为0.657(P=0.011),提示ECH1具有一定的HCC预测标志物价值。DSP与正常组相比,HCC组DSP表达下调(P=0.017)。在HCC组中,基因变异人群DSP表达上调(P=0.023),提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与DSP表达增加有关;正常人群DSP的表达与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。ROC曲线下面积为0.648(P=0.017),提示DSP具有一定的HCC预测标志物价值。结论1.POR位点rs10954732(G>A)基因变异降低HCC发生风险,其保护作用可能与CYP2E1活性降低,以及HPN、CXADR、DHRS3、RAP2C、ECH1和DSP表达增加有关。其中,CXADR高表达的HCC患者CYP2E1活性降低。2.HPN高表达的HCC患者生存时间延长。