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啤酒酵母不含有能够利用淀粉的淀粉酶基因,致使啤酒发酵结束后一些残糖和大分子量的寡糖存留,导致啤酒的热量增加。啤酒泡沫稳定性是衡量啤酒质量的一个重要指标,蛋白酶A由PEP4基因编码,能够降解啤酒发酵中维持啤酒泡沫稳定性的蛋白如蛋白脂转运蛋白1,导致啤酒泡沫稳定性降低。乙醇脱氢酶Ⅱ由ADH2基因编码,能够催化乙醇到乙醛的反应,乙醛赋予啤酒一种不愉快的青苹果味道。在本研究中我们首先从扣囊腹膜酵母中扩增了糖化酶基因GAI,然后通过同源重组将含有GAI基因的表达盒整合到酿酒酵母YSF-5的PEP4基因内部,构建了PEP4基因破坏GAI基因表达的重组酿酒酵母工程菌Ts-10。重组菌在含有淀粉的YNB培养基中筛选得到,PCR验证该菌就是所要的转化子。低温发酵Ts-10的最大糖化酶活性为91.69Uml-1,整个发酵过程中几乎检测不到蛋白酶A活性。实际抽提物和主要残糖麦芽三糖分别比受体降低了21.07%和14%,泡持时间比受体提高了39s,影响风味的主要物质如双乙酰、戊二酮、乙醛分别比受体降低了16%,13%和14%。结果表明转化子Ts-10不仅热量降低同时泡沫稳定性提高,且具有较好的风味。
为了进一步降低啤酒的热量。我们又从扣囊腹膜酵母中扩增了α-淀粉酶基因AMY,然后将含有AMY基因的表达盒整合到酿酒酵母YSF-5和已经构建的重组酵母工程菌Ts-10的乙醇脱氢酶Ⅱ基因ADH2内部,构建了能够表达AMY同时ADH2基因被破坏的重组酿酒酵母工程菌A6-1和S2-1。我们从α-淀粉酶酶活,发酵度,实际抽提物,总糖含量等方面比较了已经构建的酵母工程菌S2-1(pep4Δ:GAIand adh2Δ:AMY),TS-10(pep4Δ:GAI),A6-1(adh2Δ:AMY)和YSF-5。结果表明同时表达AMY和GAI勺重组酵母工程菌S2-1与比单独表达AMY和GAI的重组酵母工程菌A6-1和Ts-10相比,实际发酵度、α-淀粉酶活性和糖利用率均有提高。并且重组酵母工程菌S2-1比A6-1和Ts-10发酵液中的实际抽提物含量低。这些结果表明在重组酵母工程菌S2-1中,AMY基因和GAI基因能够同时表达,相互作用,提高发酵液中的糖的利用率。另外由于S2-1中ADH2基因的一个拷贝被破坏,S2-1与受体比较,发酵液中乙醇脱氢酶Ⅱ活性和乙醛含量均有降低。
总之,我们首次通过同源重组构建了能够同时表达AMY和GAI的重组酵母工程菌S2-1,其具有较高的糖利用率和优良的性能,且因为其所有的外源片段来自酵母,不含任何细菌和酵母抗性基因,应用于啤酒生产较为安全。本论文解决了啤酒的热量问题,同时提高了啤酒的泡沫稳定性降低了啤酒中乙醛以及其他一些影响啤酒风味的物质的含量因此具有很重要的意义。