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研究目的1-溴丙烷(1-bromopropane,1-BP)是一种挥发性有机溶剂,其半衰期短,对臭氧层破坏作用小,是氟氯烃类等臭氧层破坏物质的替代剂,广泛用于精密仪器清洗,目前也常替代有潜在致癌危险的干洗剂用于干洗行业。随着1-BP使用量和生产量的日益增多,暴露人群逐渐扩大,近年来国内外不断有1-BP神经中毒的病例报道,中毒病人一般首先表现出中枢神经系统(central nervous system,CNS)受损症状如头疼、头晕、记忆障碍、焦虑或抑郁等,并逐渐出现周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)损伤症状如四肢麻木、下肢振动觉减弱,严重者表现为共济失调,甚至瘫痪。1-BP的神经毒性与其他有机溶剂神经中毒表现出明显不同,中毒病例和动物实验观察到1-BP引起的CNS损伤表现明显。由于1-BP神经毒性的确切机制尚不明确,临床上目前也无特异有效的治疗措施。先前的研究显示1-BP的神经毒性与其导致大脑的氧化应激和炎性反应密切相关。依达拉奉(edaravone,EDA)为3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮,因其.具有较强的清除自由基和抗炎作用,自2001年起在临床上用于缺血性脑血管病再灌注引起的氧化损伤治疗。因此,在本实验中,采用1-BP诱导1-BP中枢神经毒性,并给予不同剂量的EDA进行干预,通过Morris水迷宫实验检测实验动物认知功能变化,检测大脑线粒体活性,以及大脑氧化应激和炎性状态,观察了 1-BP的CNS毒性和EDA的保护作用,探讨1-BP的神经毒性机制和寻找有效干预靶点。研究方法1.实验动物分组和处理:SPF级雄性Wistar大鼠适应性喂养3 d后,随机分为正常对照组、1-BP 模型组、1-BP+1 mg/kg.bwEDA 组、1-BP+3 mg/kg.bw EDA组、1-BP+5mg/kg.bwEDA 组和 5mg/kg.bwEDA 对照组,每组 12 只。1-BP 采用玉米油稀释,经灌胃途径给予,剂量均为800mg/kg.bw。EDA均在1-BP染毒后4h经腹腔注射给予。对照组分别按1-BP和EDA给予方式给予等体积的溶剂。2.Morris水迷宫试验:实验第7 d采用Morris水迷宫进行连续5d的定位航行实验和1d的空间探索实验,分别评价实验动物的学习能力和空间记忆能力。3.大脑组织尼氏体染色:采用冷冻切片机以冠状方向对全脑组织进行连续切片。每组选取位置相同的前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)和海马(hippocampus,HPC)区域,采用硫堇染液染色后,置于显微镜下观察神经元内尼氏体的变化情况。4.大脑组织免疫组化检测:采用大脑冷冻切片,每组选取位置相同的前额叶皮质和HPC区域,分别采用抗神经元和小胶质细胞特异的标记蛋白抗体进行免疫组化染色,光镜下观察神经元丢失和小胶质细胞活化情况,并采用Image J软件进行细胞计数。5.线粒体复合体Ⅰ-Ⅳ酶活性测定:断头处死动物,制作组织匀浆,分别检测大脑皮层线粒体复合体Ⅰ～Ⅳ酶活性变化。6.炎性因子和氧化抗氧化指标的检测:采用ELISA法检测大脑组织TNF-α含量,生化法分别大脑组织一氧化氮(nitric oxide,NO)、GSH、GSSG含量,并计算GSH/GSSG比值。结果1.Morris水迷宫实验结果显示,1-BP模型组动物给予800 mg/kg.bw 1-BP染毒后,水迷宫实验中第2～5d的逃避潜伏期分别比对照组增加了 60.8%,81.9%,124.0%和 323.3%,游泳总距离增加了 47.0%,66.4%,106.0%和 277.6%,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。空间探索实验中,1-BP模型组动物穿越平台次数也较正常对照组明显减少(P<0.01);给予1-BP同时给予不同剂量的EDA,其中1-BP+EDA 5mg/kg。组大鼠第4d和第5d的逃避潜伏期分别比BP组减少了 38.4%和 44.3%(P<0.01),游泳总距离减少了 34.5%和 43.3%(P<0.05,P<0.01)。2.病理形态学观察到1-BP模型组大鼠大脑PFC小胶质细胞激活明显,神经元丢失,细胞计数后与对照组比较差异显著(P<0.05,P<0.01),给予EDA后动物大脑前额叶皮质小胶质细胞活化和神经元丢失明显减轻。1-BP导致大鼠大脑前额叶皮质神经元明显减少(P<0.01),3 mg/kg.bw和5 mg/kg.bw的EDA能够明显抑制1-BP导致的神经元丢失(P<0.05,P<0.01)。尼氏染色结果与NeuN免疫组化染色结果趋势一致。3.1-BP明显降低大脑前额叶皮质细胞线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性(P<0.05,P<0.01)。1-BP染毒同时给予不同剂量的EDA,大鼠大脑前额叶皮层线粒体复合体活性均有不同程度的升高。4.1-BP染毒能够升高大脑NO及TNF-α含量,1-BP模型组动物大脑组织中NO、TNFα含量分别比正常对照组增加了 147.6%(P<0.05)和18.7%(P<0.01)。1-BP+1mg/kg.bwEDA、1-BP+3mg/kg.bw 和 1-BP+5mg/kg.bwEDA 组,NO 分别比1-BP 模型组降低了 53.8%,55.4%和 59.8%,TNF-α 分别降低了 12.2%、15.8%和22.2%,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。1-BP模型组动物大脑皮层GSH含量也较对照组明显降低(P<0.01),GSSG含量显著升高(P<0.01),GSH/GSSG比值明显降低(P<0.01);5mg/kg.bw剂量的EDA能够明显逆转1-BP导致的GSH含量降低(P<0.01),3mg/kg.bw和5mg/kg.bw的EDA能够明显升高GSH/GSSG比值(P<0.01)。结论1.1-BP能够引起大鼠学习记忆下降,可能与1-BP导致与学习记忆功能的相关的PFC及HPC区域神经元受损有关。2.1-BP能够激活大脑小胶质细胞,并使NO含量升高、炎性因子TNF-α表达上调,导致炎性反应。EDA减轻1-BP中枢神经毒性的作用可能与其抑制1-BP暴露引起的神经炎症密切相关。3.1-BP损伤大脑皮质线粒体,导致氧化应激,GSH耗竭升高细胞内GSH/GSSH比值。EDA能够保护线粒体,减轻1-BP引起的氧化应激,进而减轻1-BP对神经元的损伤。