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目的:研究雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)抗新生血管形成提取物的制备工艺、质量标准,并初步探讨其药理活性,为进一步研究开发抗肿瘤新药提供实验基础及理论依据。
方法与结果:采用反相高效液相法测定雷公藤中雷公藤甲素的含量,结果表明该法的线性、加样回收率、精密度及重复性等指标均符合分析的要求,可用于雷公藤药材及提取物制备工艺的质量评价。
采用正交设计法确定雷公藤提取物的初提工艺为加热回流提取法:以5倍量95%乙醇浸泡12 h,用浸泡液直接回流提取1 h,移出提取液;加入2.5倍量95%乙醇回流提取1 h,移出提取液;最后加入2.5倍量95%乙醇回流提取0.5 h,将三次提取液合并。采用静态吸附法优选出大孔树脂的型号为Diaion HP-20。通过对吸附和解吸条件的考察,确定了以下纯化工艺条件:上样溶液浓度为0.8g/mL,25%乙醇溶解,将溶液以4BV/h的流速通过HP-20树脂柱进行吸附,然后用25%乙醇以4 BV/h的流速洗脱5 BV淋洗杂质,再用80%乙醇以4 BV/h的流速洗脱5 BV。以对肝癌细胞SMMC-7721、胃腺癌细胞SGC-7901、BGC-823和人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖抑制活性为导向(MTT法),将80%乙醇洗脱物确定为雷公藤抗新生血管生成提取物。
建立了雷公藤提取物中雷公藤甲素、雷公藤精碱、Wilfornine F的高效液相色谱含量测定方法:用YMC-Pack ODS-A(4.6mm×150 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长210nm,柱温25℃。结果显示,雷公藤甲素、雷公藤精碱、WilfornineF在一定范围内均呈良好线性关系,平均加样回收率分别为99.84%、99.08%、98.81%,RSD分别为1.42%、1.40%、1.33%(n=6)。
以《中国药典》2005年版一部为参照标准,对雷公藤提取物进行了性状、鉴别(化学鉴别、高效液相色谱鉴别)、检查(干燥失重、水分、炽灼残渣、重金属、砷盐)等项目的质量标准研究;采用本文建立的高效液相色谱条件,对雷公藤提取物中雷公藤甲素、雷公藤精碱、Wilfornine F的含量标准进行了研究,并首次起草了《雷公藤提取物的质量标准草案及起草说明》。
通过影响因素试验,对雷公藤提取物的稳定性进行了研究。结果表明,雷公藤提取物在高温(60℃)、高湿(RH 92.5%)和强光照射(4500Lx±500Lx)条件下至少稳定10天。采用MTT法研究了雷公藤提取物对3种肿瘤细胞株、人脐静脉内皮细胞的增殖抑制活性,采用HUVEC细胞迁移实验、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验研究了雷公藤提取物抗新生血管生成作用。结果表明:80%乙醇洗脱物对BGC-823、SGC-7901、SMMC-7721及HUVEC均有较好的增殖抑制作用,IC50分别为6.43μg/mL、8.20μg/mL、5.50μg/mL、6.26μg/mL;并能抑制HUVEC细胞的迁移及鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成。
结论:本文制定的雷公藤提取物的制备工艺稳定可行;按该工艺制备的雷公藤提取物中雷公藤甲素含量是原药材中的70倍左右;该提取物具有显著的抗新生血管生成作用,可将其作为抗新生血管生成活性提取物进一步研究,以确定其应用前景。