熊果苷,属于氢醌葡萄糖苷类化合物,化学名为4-羟苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。最早,熊果苷被用于酪氨酸酶抑制剂,发挥了较好的美白效果,且已被国内外广泛地应用于化妆品美白行业。近来,研究报道熊果苷还具有显著的利尿、抗菌、消炎、镇咳、抗氧化和抗癌等多种药理活性。但由于熊果苷分子中存在多个水溶性酚羟基,所以,熊果苷的脂溶性差,难于透过双脂层细胞膜,致使其难以到达靶向作用点而生物活性降低。目前,研究报道利用非水相酶催化技术对熊果苷进行衍生化的修饰,在提高熊果苷的稳定性和生物活性等方面取得了很好的研究成果。首先,采用非水相反应体系成功完成了熊果苷酶促乙酰化反应,并对影响熊果苷非水相酶促乙酰化反应的主要因素,如酶源、溶剂、酰基供体、水活度、反应温度和加酶量等进行了优化研究,获得熊果苷非水相酶促乙酰化反应条件为酶源CSL,最佳溶剂为THF,乙酸乙烯酯为酰基供体,最佳水活度为0.63,反应温度控制为40℃,最适酶量为100 mg。在此最佳反应条件下,最高酶活为3.71±0.13μmol/h/mg,反应24 h时,最大转化率为91.42±2.43%,经核磁波谱仪鉴定反应产物为6′-乙酰化熊果苷(>99%)。为了提高熊果苷非水相酶促反应的酶活,实验采用了微波加热辅助熊果苷非水相酶促反应。实验结果表明,合适的微波辐射条件可以显著的提高熊果苷酶促乙酰化反应的酶活,缩短反应时间。进一步采用响应面统计学分析方法进行优化和验证后,得到脂肪酶CSL催化熊果苷乙酰化反应的最佳微波功率为400 W,微波温度60℃,微波条件下aw为0.41。在此最适的微波加热反应条件下,CSL催化熊果苷乙酰化反应的最高酶活为15.68±0.15μmol/h/mg,比传统的加热方式酶活提高了4倍多。反应2 h左右即可达到90%以上的转化率。为了探究熊果苷酶促乙酰化的意义,实验通过经典的总抗氧化能力、DPPH自由基、ABTS自由基、铁离子还原能力和超氧阴离子自由基的清除力等方法,全面考察了6′-乙酰化熊果苷的体外抗氧化能力。实验发现,6′-乙酰化熊果苷的体外抗氧化能力较强,与常用抗氧化剂BHT和Vc的抗氧化能力相近或略低,但6′-乙酰化熊果苷的体外抗氧化能力均稍低于熊果苷母体。随后,实验发现6′-乙酰化熊果苷的亲脂性要高于熊果苷母体,所以初步预期6′-乙酰化熊果苷会增加透过脂质双层细胞膜的机会,更好地发挥其在生物体内的生理作用。为了验证以上的推测,实验采用秀丽隐杆线虫为活体模型,探索了6′-乙酰化熊果苷的体内抗氧化作用。实验通过对线虫的寿命,产卵和运动等生理表型及对热、化学氧化和紫外辐射等不良环境抵御能力的观测,显示经6′-乙酰化熊果苷干预的线虫平均生存时间延长,运动更加活跃,与对照组相比,差异极显著(p<0.01),具有统计学意义,且并不影响线虫的生殖。同时,实验进一步证实6′-乙酰化熊果苷能够增强线虫对热、化学氧化剂胡桃琨和紫外辐射等不良环境的抵抗能力。另外,通过半定量PCR法测定线虫体内衰老相关基因daf-16、skn-1、hsp-16.2、hsf-1和hsp-70的表达都明显上调,与6′-乙酰化熊果苷能够显著的延长线虫的寿命结果相一致。可见,6′-乙酰化熊果苷具有很好的生物体内抗氧化和延缓衰老的作用。为了更好的发挥6′-乙酰化熊果苷的体内抗氧化作用,将其应用于美白和抗肿瘤领域。实验进一步利用生理功能近似的小鼠B16黑色素瘤细胞株作为受试细胞,考察了6′-乙酰化熊果苷的美白去色素和抗黑色素瘤的生物活性。对比研究了熊果苷及其6′-乙酰化熊果苷在抑制小鼠B16细胞黑色素合成、酪氨酸酶活性及抗细胞增殖和迁移等方面的生理活性,并通过线粒体膜电位和western blotting分子生物学实验探索了其对细胞凋亡的作用机理。随后,进一步研究了6′-乙酰化熊果苷对BALB/c裸鼠体内黑色素瘤增殖的影响。实验结果表明6′-乙酰化熊果苷能够显著的抑制酪氨酸酶活性,降低小鼠黑色素瘤B16细胞的黑色素合成,并且能够有效的抑制小鼠B16细胞的增殖和迁移,并引起G1期细胞停滞,通过抑制Bcl-2和Bcl-xL两种蛋白的表达,引起线粒体损伤,并通过caspases线粒体依赖途径诱导细胞凋亡。另外,通过细胞划痕实验和transwell迁移实验发现6′-乙酰化熊果苷能够显著的抑制小鼠黑色素瘤B16细胞的迁移。更重要的是,实验进一步发现6′-乙酰化熊果苷能够显著的抑制BALB/c裸鼠体内黑色素瘤的增殖。可见,6′-乙酰化熊果苷不仅可作为有效的皮肤美白剂,而且具有治疗黑色素瘤的潜在应用价值。