卵泡由卵母细胞和围绕在其周围的多层颗粒细胞组成,卵泡最外层的细胞层是卵泡膜细胞。基底膜将卵泡膜细胞和颗粒细胞层分开,同时将所有血管从卵泡内部隔离。随着促性腺激素（Gonadotropin,Gn）的作用,卵泡直径增大伴随颗粒细胞增殖和功能分化。颗粒细胞间分泌及积聚的液体量增加,形成窦卵泡腔。卵泡液（Follicular fluid,FF）将颗粒细胞分隔成两个细胞亚群,包括衬在卵泡壁上的壁层颗粒细胞（Mural granulosa cells,mGCs）和围绕在卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞（Cumulus granulosa cells,c GCs）当优势卵泡发育成熟时,由于mGCs数量的增加,消耗并阻止氧气扩散到卵泡腔,以及基底膜的阻隔作用和卵泡膜细胞层中血管密度减少,卵泡发育维持短暂的低氧环境。卵母细胞的发育、成熟、受精以及胚胎发育过程需要线粒体氧化磷酸化产生大量三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）提供能量。但因卵母细胞直接利用葡萄糖产能效率低,因此需要通过单羧酸转运系统将颗粒细胞糖酵解途径产物丙酮酸转运至卵母细胞的线粒体中,作为卵母细胞ATP能量产生的底物。线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）是细胞活力的重要指标。线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）是维持线粒体功能和细胞生长的关键。氧化应激（Oxidation stress,OS）过程产生的活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）可损伤线粒体功能,通过脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤影响细胞正常功能。在卵巢发育周期中,颗粒细胞对氧化应激反应过高,可引起mtDNA拷贝数降低,MMP下降,严重者可引发细胞凋亡。多囊卵巢综合征（Polycystic ovarian syndrome,PCOS）是育龄期女性最常见生殖内分泌疾病之一,以卵巢内持续存在卵泡发育成熟障碍为特征。在进行体外受精-胚胎移植（In vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）过程中发现PCOS患者卵子及胚胎质量下降,妊娠结局并不理想。低氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）被认为是在细胞氧稳态调节过程中起核心作用的细胞分子水平的调节物质,参与细胞的氧稳态、生长发育、缺氧适应、能量代谢等重要活动。目前关于PCOS卵泡成熟障碍及卵母细胞发育潜能降低的原因尚未明确。我们推测卵巢颗粒细胞能量代谢功能受损进而干扰低氧环境促颗粒细胞增殖作用,可能是PCOS患者卵母细胞发育潜能下降的机制之一。本研究分为两部分,第一部分对IVF-ET中PCOS患者和输卵管因素不孕患者临床资料特征、卵子及胚胎发育结局、卵泡液氧化/抗氧化应激指标丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHd G）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）水平和丙酮酸、葡萄糖水平进行比较,对壁层颗粒细胞中MMP、ATP、ROS和mtDNA拷贝数变化及糖酵解相关基因GLUT1,LDHA与PFKP mRNA表达水平进行比较,分析卵泡液氧化应激对卵子发育、成熟、受精及早期胚胎发育的影响,提示颗粒细胞线粒体功能损伤及糖酵解异常干扰卵泡液微环境稳定,参与PCOS卵泡发育异常过程。第二部分以体外培养的人mGCs为研究对象,加入线粒体抑制剂（Carbonyl cyanidem-chlorophenyl hydrazine,CCCP）和糖酵解抑制剂（Bromopyruvic acid,BA）及低氧诱导剂二氯化钴（Cobalt dichloride,CoCl2）,研究颗粒细胞能量代谢途径转变与细胞活力改变的关系及线粒体功能稳定对低氧促代谢转换的保护作用。第一部分PCOS卵泡氧化应激及颗粒细胞能量代谢与卵母细胞发育的关系目的:分析PCOS患者和单纯输卵管不孕患者临床特征及IVF-ET治疗结局,检测两组不孕人群卵泡液中氧化应激标记物含量、颗粒细胞线粒体功能及糖代谢水平,探讨PCOS对早期胚胎发育的影响及与颗粒细胞能量代谢功能减低之间的关系。方法:1. 选取2018年4月-2018年12月期间年龄匹配需行IVF-ET助孕患者共158例,其中符合2003年鹿特丹诊断标准的PCOS患者60例,设为PCOS组,单纯输卵管因素不孕患者98例,设为对照组。记录并比较两组患者的卵子及胚胎发育指标、临床妊娠率。2.选取卵泡液（PCOS组40例,对照组50例）,ELISA方法检测卵泡液中氧化应激损伤标记物MDA、8-OHd G及抗氧化应激指标SOD水平,同时试剂盒检测卵泡液葡萄糖及丙酮酸水平。3.将两组mGCs体外培养,待细胞贴壁后采用MMP、ATP、ROS检测试剂盒检测两组颗粒细胞线粒体功能,实验至少重复三次。4.采用q-PCR方法比较两组mGCs mtDNA拷贝数、采用RT-PCR方法比较两组mGCs糖酵解相关基因GLUT1、LDHA、PFKP和低氧相关基因HIF-1αmRNA表达情况,实验至少重复三次。结果:1. 患者一般病例资料特点:PCOS组体重指数（Body Mass Index,BMI）、基础LH、T、FGB水平高于对照组（P<0.05）,FSH水平低于对照组（P<0.05）。2. COH控制指标:Gn总量、Gn天数、HCG日E₂水平PCOS组与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。3.卵子及胚胎发育指标:PCOS组获卵数、受精数高于对照组（P<0.05）;两组成熟卵数、正常受精卵数、卵裂数、可利用胚胎数、优质胚胎数差异均无统计学意义（P>0.05）;PCOS组可利用胚胎率、优质胚胎率、优质囊胚形成率、临床妊娠率均低于对照组（P<0.05）。4.氧化应激标记物检测:PCOS组卵泡液中氧化损伤标记物,包括MDA、8-OHDG均高于对照组（P<0.05）,PCOS组抗氧化损伤指标SOD较对照组升高（P<0.05）。5.卵泡液内糖代谢指标:PCOS组丙酮酸含量低于对照组（P<0.05）,葡萄糖含量高于对照组（P<0.05）。6.mGCs线粒体功能:和对照组相比,PCOS组MMP、ATP及mtDNA拷贝数显著降低（P<0.01）,ROS水平显著升高（P<0.01）。7.mGCs糖代谢功能:PCOS组GLUT1、LDHA、PFKP表达量低于对照组,且与低HIF-1αmRNA表达水平呈正相关（P<0.05）。小结:PCOS患者优质胚胎形成率、优质囊胚形成率和临床妊娠率均下降,卵泡液微环境存在氧化应激的过度表达,mGCs氧化损伤及能量代谢失调可能干扰颗粒细胞对卵母细胞供能,影响卵母细胞及早期胚胎发育潜能。第二部分低氧对颗粒细胞能量代谢转换的促进作用及与颗粒细胞线粒体功能的关系目的:通过CCCP及BA加药处理,观察mGCs线粒体功能变化;加入CCCP可以降低mGCs线粒体功能,建立线粒体功能障碍模型,加入CoCl2可以诱导低氧环境,建立低氧模型,通过两种模型分析mGCs糖酵解水平及细胞活力变化,研究低氧对代谢方式转换的促进作用,验证颗粒细胞线粒体功能稳定对低氧促代谢转换及促细胞增殖的保护机制。方法:1.取单纯输卵管因素不孕患者mGCs进行体外培养,将颗粒细胞分为对照组（不加药组）、CCCP组、BA（0.5 mM）组和BA（2.5 mM）组,待细胞贴壁后分别加入线粒体抑制剂CCCP（10μM）和糖酵解抑制剂BA（0.5mM/2.5 mM）,应用MMP、ROS、ATP检测试剂盒对四组颗粒细胞线粒体MMP、ATP、ROS水平进行检测,实验至少重复3次。2.荧光显微镜观察加入CCCP（10μM）和糖酵解抑制剂BA（0.5 mM）后mGCs MMP变化,实验至少重复3次。3. 收集15例单纯输卵管因素不孕患者mGCs进行体外培养,RT-PCR方法检测加入CCCP（10μM）后HIF-1α及糖酵解相关基因GLUT1,LDHA,PFKP mRNA表达水平。4.留取mGCs进行体外培养,将mGCs分为对照组（不加药组）、CCCP组和CoCl2组,待细胞贴壁后分别加入线粒体抑制剂CCCP（10μM）和CoCl2（100μM）,培养24、48和72小时,应用CCK8试剂盒检测细胞活力,葡萄糖试剂盒检测葡萄糖消耗量,RT-PCR方法检测HIF-1α及糖酵解相关基因GLUT1、LDHA和PFKP mRNA表达水平,实验至少重复3次。结果:1.与对照组比较,经CCCP（10μM）和BA（0.5 mM/2.5mM）加药处理后,MMP、ATP均显著下降（P<0.01）。2.与对照组比较,经CCCP（10μM）和BA（0.5 mM/2.5mM）加药处理后,CCCP组及BA（0.5 mM）组ROS水平稍有升高,但无统计学差异（P>0.05）,而BA（2.5mM）组ROS水平显著升高,有统计学差异（P<0.05）。3.应用线粒体功能障碍模型,检测mGCs中HIF-1α、GLUT1和LDHA mRNA表达较对照组显著升高（P<0.05）,PFKP mRNA表达水平升高,但无统计学差异（P>0.05）。4. 应用低氧模型,检测mGCs中GLUT1、LDHA和PFKP mRNA表达较对照组显著升高（P<0.05）,HIF-1αmRNA表达无显著改变（P>0.05）。5. 经CCCP（10μM）和CoCl2（100μM）加药处理后的mGCs继续培养24、48和72小时,mGCs葡萄糖消耗量均增加,以加药后72小时葡萄糖消耗量最高（P<0.05）。CCCP组和CoCl2组72小时葡萄糖消耗量显著高于对照组（P<0.05）。6. 经线粒体抑制剂CCCP（10μM）和CoCl2（100μM）加药处理后的mGCs继续培养24、48和72小时,两组细胞活力逐渐升高,以加药后48、72小时升高最显著,差异具有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较,经CCCP处理后的mGCs培养24和48小时,细胞活力降低,而培养72小时后与对照组比较无显著差异;CoCl2组24、48和72小时细胞活力均增加,明显高于对照组及CCCP处理组,差异具有统计学意义（P<0.05）。小结:颗粒细胞在卵泡发育和成熟的后期有线粒体氧化磷酸化及糖酵解两条能量代谢途径,共同参与维持卵泡内环境稳定;线粒体功能稳定和低氧环境促进了卵泡发育过程中颗粒细胞能量模式向糖酵解方式转换。结论:1.PCOS患者优质胚胎形成率、优质囊胚形成率和临床妊娠率均下降,卵泡液微环境存在氧化应激的过度表达和糖代谢紊乱可能影响卵母细胞及早期胚胎发育潜能。2.PCOS患者mGCs线粒体功能受损,MMP、ATP降低,ROS水平升高,伴随mtDNA拷贝数降低,同时糖酵解相关基因表达下降,影响颗粒细胞糖代谢活动。颗粒细胞氧化损伤及能量代谢失调干扰颗粒细胞对卵母细胞的供能,可能是PCOS患者卵母细胞发育潜能下降的机制之一。3.加入线粒体抑制剂CCCP及糖酵解抑制剂BA后线粒体功能发生变化,提示颗粒细胞内存在线粒体氧化磷酸化及糖酵解两种能量代谢方式调控颗粒细胞功能稳定。4.线粒体抑制剂CCCP降低颗粒细胞线粒体膜电位,改变线粒体功能,进而降低细胞活力,但随着HIF-1α表达增加,颗粒细胞糖代谢活性逐渐增强,促进细胞活力提高。5.低氧诱导剂CoCl2提高颗粒细胞糖代谢活性和细胞活力,说明颗粒细胞线粒体功能稳定对低氧促进代谢模式转换及促进细胞增殖活性具有一定保护作用。