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犬瘟热（canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）引起的一种急性、发热性、高传染性动物传染病,具有极高的发病率和致死率。CDV不仅可感染常见的犬科、猫科动物,还可感染浣熊科、鼬科、臭鼬科、熊猫科及海豹科等多种野生动物。可见CD对犬、野生动物及珍稀保护动物的养殖及保育工作都造成了严重危害。疫苗免疫是预防犬瘟热有效的方法之一,但目前未见应用于野生动物的犬瘟热疫苗,目前犬用疫苗为犬瘟热减毒活疫苗,而减毒活疫苗的使用一定程度上存在毒力返强的潜在风险,因此研制更安全有效的犬瘟热疫苗具有重要意义。人5型腺病毒作为病毒载体被广泛应用于疫苗开发,腺病毒载体具有以下优点:良好的安全性;表达多个基因;病毒生长滴度高;可通过多种途径刺激机体产生高效免疫反应。因此,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,联合Gateway技术分别构建表达CDV F和CDV H重组腺病毒,并研究其免疫原性。本研究利用无缝克隆技术将绿色荧光蛋白基因（EGFP）和CDV11F/CDV11H基因分别连接到入门载体p ENTRTM/D-TOPO中,获得重组入门质粒p ENTR-EGFP-CDV11F和p ENTR-EGFP-CDV11H。随后分别将EGFP-CDV11F和EGFP-CDV11H插入到腺病毒骨架载体中,获得重组质粒p Ad-EGFP-CDV11F和p Ad-EGFP-CDV11H,并将鉴定正确的重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后转染至293A细胞中以拯救重组腺病毒rAd-EGFP-CDV11F和rAd-EGFP-CDV11H,并通过荧光显微镜观察、透射电镜观察、间接免疫荧光以及蛋白免疫印迹对重组腺病毒进行鉴定。将重组腺病毒rAd-EGFP-CDV11F和rAd-EGFP-CDV11H分别通过肌肉注射（Intramuscular injection,i.m.）和滴鼻（Intranasal injection,i.n.）途径单独及混合免疫小鼠,并测定免疫后第7、21及35天小鼠体内抗CDV中和抗体、特异性结合抗体及抗体亚型的变化情况;35 dpv时检测肺泡分泌型Ig A抗体水平、脾淋巴细胞IL-4和IFN-γ的分泌水平及细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α）分泌水平。将重组腺病毒rAd-EGFP-CDV11F和rAd-EGFP-CDV11H分别通过肌肉注射（Intramuscular injection,i.m.）和口服（peros）途径单独及混合免疫比格犬,并测定免疫后第14、28、42及56天比格犬体内抗CDV中和抗体、特异性结合抗体。结果显示,经荧光显微镜及透射电镜可观察到rAd-EGFP-CDV11F/rAd-EGFP-CDV11H感染293A及Vero细胞后呈现绿色荧光信号,在透射电镜下呈典型的二十面体结构;经间接免疫荧光以及Western-blot鉴定重组腺病毒在感染293A细胞、Vero细胞后可被抗CDV F/H蛋白抗体特异性识别,在约78KDa/81KDa处显示特异性条带;rAd-EGFP-CDV11F/rAd-EGFP-CDV11H滴度分别达1.62×10~9IFU/m L和1.5×10~9IFU/m L。重组腺病毒rAd-EGFP-CDV11F和rAd-EGFP-CDV11H免疫小鼠后结果显示,在肌肉注射免疫方面,i.m.H免疫组CDV中和抗体效价最高可达1:64,i.m.F和i.m.H免疫组小鼠特异性Ig G抗体效价可达1:4096～1:25600,Ig G2a/Ig G1＜1,免疫后脾淋巴细胞IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子分泌显著升高。在滴鼻免疫方面,i.n.H免疫组小鼠CDV中和抗体效价最高可达1:16,i.n.F和i.n.H免疫组小鼠特异性Ig G抗体效价可达1:6400～1:25600,Ig G2a/Ig G1＜1,小鼠肺泡灌洗液SIg A效价在1:200～1:800,免疫后脾淋巴细胞IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α细胞因子分泌均显著升高。上述结果表明,重组腺病毒载体疫苗经肌肉注射和滴鼻免疫均能诱导强烈的Th1型和Th2型免疫应答,此外重组腺病毒rAd-EGFP-CDV11H经滴鼻免疫可诱导良好的SIg A为主的黏膜免疫应答。重组腺病毒rAd-EGFP-CDV11F和rAd-EGFP-CDV11H肌肉注射及口服免疫比格犬后结果显示,i.m.CDV11H免疫组比格犬CDV中和抗体效价最高可达1:16,i.m.CDV11H免疫组比格犬特异性Ig G抗体效价可达1:12800。上述结果表明重组腺病毒经肌肉注射及口服免疫犬可诱导一定的体液免疫应答。综上所述,本研究成功构建了两株分别表达CDV11 F和H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒rAd-EGFP-CDV11F和rAd-EGFP-CDV11H,两株重组腺病毒经肌肉注射及滴鼻免疫小鼠可诱导机体产生体液及细胞免疫应答,经滴鼻免疫还可诱导黏膜免疫应答。两株重组腺病毒经肌肉注射及口服免疫比格犬可诱导机体产生体液免疫应答。本研究构建的重组腺病毒具有作为CDV重组腺病毒载体候选疫苗及黏膜免疫候选疫苗的潜力。