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目的 80年代起，肺癌已成为全球范围内发病率最高的癌症。肿瘤的淋巴转移是肿瘤发展过程中的一个重要组成部分，是包括肺癌在内的大多数癌症常见的扩散途径。对于大多数人类恶性肿瘤，肿瘤细胞通过淋巴管扩散到局部淋巴结是临床分期的重要指征。淋巴转移是影响术后复发及5年生存率的重要因素，也是外科手术和术后化疗的参考依据之一。淋巴管生成和血管生成为恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤、发生转移提供有利条件。在发生淋巴结转移的肿瘤基质中，常能发现淋巴管的增生和扩张，但其分子机制至今尚未充分阐明，淋巴管形成在淋巴转移中的作用还不清楚。在过去的几十年里，由于缺乏明确的淋巴管生成因子及特异的淋巴管标记因子，因此对淋巴转移的研究进展缓慢，大多都集中在对血管系统的研究上。 近年来发现了血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)及其受体VEGFR-3，目前认为VEGF-C是相对特异的淋巴管内皮生长因子，VEGFR-3是相对特异的淋巴管标记因子，从而为研究淋巴转移机制开辟了新的途径。本实验对非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)中VEGF-C、VEGFR-3的表达、淋巴管密度、血管密度进行检测，并结合完整的临床资料，分析他们的相互关系及其与非小细胞肺癌生物学特征和临床病理特征的关系。 材料与方法 1．材料 76例非小细胞肺癌组织蜡块来自辽宁省鞍山肿瘤医院1980一200年手术切除并有随访资料的标本，标本经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋。另外24例新鲜非小细胞肺癌及正常组织由中国医科大学附属第一临床医院胸外科提供。 2．主要试剂和来源 实验药品：浓缩型免抗VEGF－C多克隆抗体购自美国Zymed实验用品公司；浓缩型免抗VEGFR－3多克隆抗体购自美国SanaC。二公司；Rll用型 CD34单克隆抗体、Rg用型 s吮p胁i0n－po。－dase瞩一P）超敏免疫组化山AB显色试剂盒在用型抗体稀释液均购自福州迈新生物技术开发公司；碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG二抗购自北京中山生物技术公司；NBT／BCIP显色试剂盒购自华美生物技术公司。 3．方法 3．l 免疫组织化学检测VEGF—C、VE哑R—3、CD34蛋白表达采用链霉菌素抗生物素蛋白一过氧化物酶法u—P法人结果判定：血管密度和淋巴管密度的计数是先于低倍光镜（40倍和100倍）下确定3个血管着色最密集的区域，然后在200倍视野下计数微血管，取3个视野的均值作为血管密度或淋巴管密度。VEGF一C和＊＊＊FR－3的计数以阳性细胞占癌细胞总数＞10％为阳性。 3．2 Western Blot检测 VEGF－C在正常肺组织和非小细胞肺癌中的表达。取新鲜样品O一2）克加5倍湿重的裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳、转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。 4．统计学分析 采用SPSS for Windows 10．0统计分析软件，采用t检验、方差分析、线性相关与回归《’检验等统计学方法，0．of＜P＜0．05有统计学差异，P＄0．of为有显著统计学差异。对生存数据采用Ka．plan－Meter分析并绘制生存曲线，用or－rank检验差异性；用COX模型进行多因素分析，P＜0．二者归人模型。 ·2· 结 果 1．正常肺组织及非小细胞肺癌组织中VEGF－CJEGFR－3的表达 VEGF－C在非小细胞肺癌中定位于癌细胞胞浆，肺癌间质和癌旁正常肺泡无表达。VEGFR－3定位于癌细胞胞浆和淋巴管内皮细胞胞浆，VEGF—C阳性和阴性表达的肺癌细胞中的VEGFR－3表达存在显著性差异。Western blot结果显示，24例新鲜的非小细胞肺癌组织中，存在分子量大约为29 kDa和31 kDa的蛋白条带，对应于 VEGF—C蛋白的分子量；NSCLC中 VEGF－C的表达明显高于正常肺组织。 2．VEGF－C、VEGFR－3表达与 NSCLC临床病理特征关系 有淋巴结转移、淋巴管浸润病例中VEGF－C和VEGFR－3的表达高于无淋巴结转移、无淋巴管浸润病例中的表达。VEGF－C的表达在高分化癌和低分化癌的差异有统计学意义。VEGF－C与VEGFR－3在肺癌细胞中的表达与患者的年龄、性别、组织类型、血行转移和临床分期无关。 3．血管密度和淋巴管密度与非小细胞肺癌中与VEGF－C表达及临床病理特征的关系 淋巴管密度与淋巴结转移、淋巴管浸润、TNM分期、VEGF－C表达呈正相关。与组织类型、分化程度和血行转移无关。MVD与血行转移JNM分期JEGF－C表达呈正相关，与组织类型、分化程度、淋巴转移和淋巴管浸润无关。 4．VEGF－C、VEGFR－3表达及微血管密度、淋巴管密度与非小细胞肺癌预后关系 Kaplan－Meter生存曲线分析，VEGF－C表达与生存率负相关，log－rnk检验 VEGF－C表达阳性组和表达阴性组的生存曲线差异有显著性意义。COX多因素分析，VEGF－C表达是影响预 ·3·后有意义的风险因素。微血管密度、淋巴管密度与预后无关。