缺血性心脏病（IHD）是当代人类发病率和致死率较高的疾病之一，由于冠状动脉的狭窄和闭塞产生组织供血和供氧缺乏，产生心绞痛、心肌梗死、心律失常、心功能衰竭和猝死，目前主要的治疗措施是开胸手术进行冠状动脉旁路移植（CABG）、经皮腔内球囊血管扩张（PTCA）或者药物治疗，尽管已取得了很大的进步，但仍有约5％的患者因严重而弥漫的病变、缺乏血管桥和吻合血管以及高手术危险等而不适合以上的治疗措施。 各种血管生长因子的相继发现给IHD患者的治疗带来了希望，心肌缺血可诱导一些生长因子的产生形成一定数目的侧枝血管，但不能满足自身的需要，研究者开始尝试增加缺血区生长因子浓度的方式，以其通过增加侧枝血管的生长而减轻心肌缺血、预防心肌梗死和保存心脏的功能，即“治疗性血管新生”（TherapeuticAngiogenesis），近年的研究预示这将为IHD的治疗提供一条全新而有效的途径。 目前研究的血管生长因子主要集中在血管内皮生长因子A（VEGF—A）、成纤维细胞生长因子（FGF）和血管形成素（angiopoietins）等，由于各自的生物学特性和作用特点不同，缺乏相互比较，尚不能确定何者为首选。新近发现的血管内皮生长因子B（VEGF-B）结构与VEGF－A相似，分布广泛，在心脏较为丰富，与 VEGF家族的受体之一 VEGFR-1和 neuropolin-1结合，研究表明内皮细胞和其周细胞存在编码VEGF-B的mRNA，VEGF-B能够促进培养的血管内皮细胞（ECs）的生长，并增加纤溶酶的活性从而调节血管外基质的降解、细胞粘附和迁移，敲除VEGF-B基因的鼠心脏体积减小阻塞冠状动脉后的恢复受限，提示该因子影响冠状血管的发育和生长，提示有潜在的治疗作用。与 VEGF不同的是，缺氧并不明显增加VEGF—B mRNA的表达，缺血心肌VEGF－B的缺乏可能是内在血管生长不足的原因之一，目前关于VEGF-B的血管新生作用的研究尚未见报道。 基因治疗是目前研究的热点，腺病毒介导的基因转移优于直接应用蛋白和质粒载体，为了探讨腺病毒介导VEGF－B基因对缺血心肌的血管新生作用，我们首先构建了编码人VEGF-B基因的复制缺陷的重组腺病毒（Ad．VEGF－B）载体，在体外研究证实对血管内皮细胞具有促增殖作用的基础上，直接注射猪慢性缺血心肌以评价在体应用的效果。 2 男二罩巨大誉协士够位锗大 申穴凶昙 们叱外斗专业 — —： 1．VEGFB腺病毒粘粒载体（pAxCAwtEGFB CDNA）的构建 抽提人心肌组织总 RNA，经 RT－PCR合成 VEGFB cDNA，扩增后酶切鉴定，将纯化的目的基因插入测序载体 pUC，转化感受态大肠杆菌 TG；进行扩增和抽提，获得正确的目的基因 VEGF－B CDNA，插入有腺病毒基因组的粘粒载体 pAxCAWt，扩增后挑选插入方向正确的克隆。 2．VEGFB基因重组腺病毒载体Ad．VEGF－B的构建 应用磷酸钙共沉淀法将DNA－TPC和重组粘粒pAxCAwtEGF－B CDNA转染293细胞，培养8～18天后挑选病毒克隆，同样的方法构建表达大肠杆菌p一半乳糖昔酶的LacZ基因腺病毒载体，经限制性内切酶酶切鉴定正确的病毒克隆进一步扩增后氯化锥梯度超速离心，应用TICD扣法测定滴度。以Ad．LgCZ感染Hela细胞，经X名al染色确定转染效率，并初步观察转染后细胞生长和形态评价其毒性。 3．Ad．VEGFE体外转染心肌细胞和对血管内皮细胞促增殖作用的研究 分离培养胚胎鼠心肌细胞（FCM）和成鼠主动脉内皮细胞（ohCS），免疫组化鉴定，分别以不同MOI（每个细胞的病毒噬斑形成单位pm／cell）值的Ad儿acZ转染FCMs、RAECs，应用X唱al染色测定转染效率，以MOI值20的AdVEGF8感染FCMs和 RAECs，以 Ad．LacZ、PBS为对照，转染后 1、3、7天进行 RTICR检测其转录，同时应用 Western Blot检测转染后细胞培养上清 VEGF－B的表达。MTh法测定Ad．VEGFB转染后7天内对RAECS的增殖作用。 4．Ad．VEGFB转染慢性缺血心肌促血管新生作用的研究 健康家猪14只，体重25～35kg，全麻下左第四肋间前外侧切口，分出左回旋支主干，放置内径2．snun的ineroid环。4周后冠状动脉造影确定其闭塞，分组用药。组1（Ad．VEGF－B组）5只，组＊（Ad工acZ组）5只，组＊（PBS组）4只，缺血区共注射 10点，每点 100 nl，病毒量为 10vfiJ，组H和组＊于 3、7、28天各处死 1只动物，应用X唱al染色评价慢性缺血心肌的转染效果。注药后28天左右心脏彩超检查测定节段性收缩期室壁增厚分数和短轴缩短率，体外冠状动脉造影检查侧枝血管的存在和分布；组织病理学观察心肌缺血、炎症程度，凝血Vlll因子相关抗原抗体免疫组化染色，200倍视野下进行血管计数。 3 ！二旱巨大攀俗士学位论大O丈的臀 用心外科专丛 一： 1．提取的总KNA和mRNA完整