肺癌是人类最常见的癌症之一,其在全世界范围内的总体发病率和死亡率居所有的恶性肿瘤之首。近年来,由于烟草消费的持续增长、环境污染、饮食和生活方式的改变,我国肺癌的发病率和死亡率一直呈快速上升趋势,已经成为我国威胁公共健康的重要问题。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC),其中非小细胞肺癌约占肺癌的80%-85%。虽然近年来NSCLC的诊断方法和治疗手段有了很大的进步,但其预后仍然很差,在美国5年生存率为15%,在欧洲为10%,而在发展中国家仅为8.9%。目前,临床上判断NSCLC预后的主要依据仍采用TNM分期及病理学组织类型。然而却不难发现患者即使具有相同的病理组织学类型、临床分期相同、采用同样的治疗方案,其预后生存时间也存在很大差异,说明不同的NSCLC个体对治疗的反应和预后不同。因此,寻找稳定的生物分子标记物如单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNPs)预测患者的预后并指导个体化治疗,从而改善患者的生活质量和延长生存时间,是目前国内外肿瘤研究的热点。因此,在本研究中选择miRNA相关SNPs,研究这类SNPs与非小细胞肺癌预后的关联,并探索可能存在的生物学功能。第一部分 DROSHA和DICER基因多态性与晚期非小细胞肺癌预后的关联研究MiRNA是一类长度为18-24个核苷酸的非编码小分子RNA,成熟MiRNA的合成首先由细胞核内编码miRNA的基因转录形成长度为几百到几千个核苷酸的初级miRNA(pri-miRNA),然后pri-miRNA通过DROSHA酶的作用在细胞核中被剪切成长约60-70 nt、具有发夹结构的miRNA前体pre-miRNA;再经转运至细胞质中,经DICER酶的作用被进一步剪切成18-24nt的成熟miRNA。目前许多研究表明,MiRNA生物合成途径重要基因单核苷酸多态性通过影响成熟miRNA的表达水平从而对肿瘤的发生、发展、预后相关联。在本研究中我们选取了miRNA合成相关的两个重要基因DROSHA和DICER酶,利用HapMap公共数据库选取包含各基因上游10kb在内的区域,结合HaploView软件选取了36个在中国人群中最小等位基因频率(MAF)≥0.05,哈迪-温伯格平衡(HWE)≥0.05,call rate≥90%的单核苷酸多态性(SNPs)位点,设计了两阶段研究探讨这些SNPs与非小细胞肺癌预后的关联。我们的研究仅限于III期或IV期未手术、接受铂类为一线化疗的非小细胞肺癌患者。第一阶段(1期)纳入303例患者,招募于南京医科大学第一附属医院和附属肿瘤医院。第二阶段(2期)纳入340例患者,招募于上海胸科医院和南京胸科医院。所有患者均为组织病理学或细胞学确诊的NSCLC,并至少由两名病理医师确诊。1期和2期样本基因分型均采用Sequenom MassARRAY iPLEX平台。结果显示1期人群中有12个SNPs与肺癌预后相关联,在2期验证中结果显示DROSHA rs3805525与肺癌预后的关联呈边缘阳性(显性模型:校正后HR=0.69,95%CI=0.46-1.03,P=0.071),我们将1、2期人群合并分析后结果显示在总人群中有三个位于DROSHA基因上的SNPs(rs3805525,rs17410035和rs7719497)与肺癌预后显著相关(相加模型:rs3805525:校正后HR=0.82,95%CI=0.68-0.99,P=0.040;rs17410035:校正后HR=0.79,95%CI=0.62-1.00,P=0.048;rs7719497:校正后HR=0.76,95%CI=0.62-0.93,P=0.008)。阳性位点的联合分析结果显示:与携带0个保护性等位基因的个体相比,携带1个、2个及3-6个保护性等位基因的个体的生存时间延长,且随着携带保护性等位基因个数的增加,NSCLC患者的死亡风险也减少,呈现明显的剂量反应关系(趋势性P值=0.002)。此外,在分层分析研究中发现以是否吸烟进行分组时,在未吸烟的患者中,含有2-6个的保护性等位基因的患者与含有0-1个的保护等位基因的患者相比,预后较好;在以病理分期进行分组时,在IV期的患者中,含有rs17410035 T等位基因的患者与含有G等位基因的患者相比预后较好。因此,我们的研究表明,DROSHA rs3805525,rs17410035和rs7719497单核苷酸多态性可能与非小细胞肺癌患者的预后相关。第二部分 MiR-125家族调控区域遗传变异与非小细胞肺癌预后的关联研究MiR-125家族包括(hsa-miR-125a、hsa-miR-125b-1和hsa-miR-125-2),分别位于19q13、11q23、21q21。MiRNA家族的三个成员可以与不同的转录因子、基质金属蛋白酶及生长因子等相结合,调控了多种细胞不同的生理进程如细胞的分化、增殖及凋亡等。其通过对多个转录后靶基因的调控在许多肿瘤的发生发展过程中起到了关键的作用。在本研究中我们选取了miR-125家族(miR-125a,miR-125b-1,miR-125b-2)三条MiRNA本体及其上游10kb上游调控区域,利用HapMap公共数据库选取包含各基因上游10kb在内的区域,结合Haploview软件选取在中国人群中最小等位基因频率(MAF)≥0.05,哈迪-温伯格平衡(HWE)≥0.05,call rate≥90%,然后利用在线预测工具SNPinfo对筛选的所有符合上述三个条件的SNPs进行功能预测,进一步以r~2=0.8为临界值在这些功能性位点中通过连锁不平衡分析筛选标签SNPs。最终我们纳入了6个SNPs位点进行基因分型,探讨这些SNPs与非小细胞肺癌预后的关联及其可能的生物功能学机制。本研究的所有病例均来自南京及其周边地区。我们在1001例NSCLC血液标本中对选取的SNPs采用Illumina芯片技术进行基因分型。之后,我们用荧光素酶报告基因对该位点进行功能研究。Cox回归模型结果提示三个位点rs2241490,rs512932和rs8111742与中国人群非小细胞肺癌预后相关(显性模型:rs2241490:P=0.014,校正HR=1.24,95%CI=1.05-1.48;rs512932:P=0.013,校正HR=1.25,95%CI=1.05-1.48;rs8111742:P=0.047,校正HR=0.84,95%CI:0.71-1.00)。3个阳性位点的联合分析结果显示,与携带0-1个危险性等位基因的个体比较,携带2个、3个及4个以上危险性等位基因的个体的死亡风险分别增加了26%(HR=1.26,95%CI=0.95-1.67)、42%(HR=1.42,95%CI=1.08-1.88)和65%(HR=1.65,95%CI=1.22-2.24)。携带个数越多的危险性等位基因,NSCLC患者的死亡风险也逐步增加,呈现明显的剂量反应关系(趋势性P值<0.001)。分层分析结果显示,以性别进行分组时,在女性患者中,含有rs8111742 A等位基因与含有G等位基因的患者相比预后较好(调整后HR=0.65,95%CI=0.49-0.87),且两组之间存在组间差异,异质性检验P=0.007;在以肿瘤分期进行分组时,在分期为I/II期的患者中含有rs512932 G等位基因与含有A等位基因的患者相比预后较差(HR=1.53,95%CI=1.22-1.92),且两组之间存在组间差异,异质性检验P=0.003。交互作用分析显示rs512932与临床分期,rs8111742与性别之间均存在显著的相乘交互作用(rs512932与临床分期:P=0.001;rs8111742与性别:P=0.012)。荧光素酶报告基因显示rs512932 G等位基因转染细胞株时荧光素酶表达水平比rs512932 A等位基因转染时显著升高(293T:7.810 vs 1.009,P=0.002;SPCA19.119 vs.0.831,P=0.002;A549:8.206 vs.0.691,P<0.001)。我们的研究表明,rs2241490,rs512932和rs8111742可能与非小细胞肺癌患者的预后相关联。其中rs512932可能通过改变miR-125b-1与转录因子的结合能力进而影响了miR-125b的表达,从而影响非小细胞肺癌患者的预后。第三部分 MiR-9家族调控区域遗传变异与非小细胞肺癌预后的关联研究MiR-9(miR-9-1,miR-9-2,miR-9-3)最初被发现在脑组织中富集,近年来其在神经外肿瘤中的作用也逐渐被揭示,其作用涉及到包括肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、血管生成等方面,且其在不同的肿瘤中其发挥着癌基因或抑癌基因不同的作用。在我们的研究中,我们假设miR-9本体及其上游调控区域单核甘酸多肽性与非小细胞肺癌预后相关联。为了验证上述假设,我们挑选了位于三条miRNA(has-miR-9-1,has-miR-9-2,has-miR-9-3)本体及其上游调控区域,利用HapMap公共数据库选取包含各基因上游5kb在内的区域,结合Haploview软件选取在中国人群中最小等位基因频率(MAF)≥0.05,哈迪-温伯格平衡(HWE)≥0.05,call rate≥90%,然后利用在线预测工具SNPinfo对筛选的所有符合上述三个条件的SNPs进行功能预测,进一步以r~2=0.8为临界值在这些功能性位点中通过连锁不平衡分析筛选标签SNPs。最终我们选择了4个功能SNPs位点,在1001例NSCLC血液标本中采用Illumina芯片技术进行基因分型进行基因分型。并采用荧光素酶报告基因对该位点进行功能研究。结果显示其中miR-9-2 rs1501672与NSCLC患者的预后关联的结果呈边缘阳性(相加模型:校正HR:0.89,95%CI:0.79-1.00,P=0.056),rs1501672携带突变基因型GG的生存时间较携带野生基因型AA的生存时间显著延长(33.9个月对比23.4个月)。双荧光素酶报告基因结果显示rs1501672 G等位基因转染细胞株时荧光素酶表达水平比A等位基因荧光素酶表达水平显著升高(293T:6.990 vs.1.009,P<0.0001;SPCA1:9.702 vs.0.826,P=0.0009;A549:8.386 vs.0.760,P=0.0004)。我们的研究表明,miR-9-2 rs1501672单核苷酸多态性可能与非小细胞肺癌预后相关联,rs1501672潜在通过改变miR-9-2与转录因子的结合能力影响了miR-9-2的表达,进而影响非小细胞肺癌患者的预后。