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【背景与目的】“血复康”是南京中医药大学第一附属医院血液科于1989年根据中医解毒活血法独创的复方制剂,主要由青黛、莪术、葛根等组成。沈群教授课题组先前的研究已经证明血复康呈时间-浓度依赖性抑制慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia, CML)细胞株—K-562细胞(CML红白变细胞株)的增殖,促进细胞凋亡,下调CML特有的BCR/ABL致病融合基因表达；青黛、莪术及葛根单药有效成分均能通过不同途径诱导K-562细胞凋亡；临床用于治疗CML慢性期患者亦取得较好的功效。本研究采用葛根主要有效活性成分-葛根总黄酮(Puerariae radix flavones, PRF)处理不同的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞株(HL-60、Kasumi-1、NB4和U937),发现PRF可有效抑制上述细胞增殖,其中尤以NB4细胞更为显著。基于上述结果,本研究试图揭示PRF体内外诱导NB4细胞凋亡的作用及分子机制。第一部分PRF体外诱导NB4细胞凋亡的分子机制【方法】(1) 12.5-200μg/ml PRF作用于NB4细胞24、48及72小时,MTT法检测NB4细胞的增殖抑制率；(2) 50μg/ml PRF作用于NB4细胞48小时,Hoechst33258及瑞氏染色法观察细胞形态学改变；(3)50、200μg/ml PRF作用于NB4细胞48小时,流式细胞术检测细胞周期进程；(4) 12.5-200μg/ml PRF作用于NB4细胞24及48小时,FITC-AnnexinV/PI双染法检测细胞早期凋亡率改变；(5) 50μg/ml PRF作用于NB4细胞48小时,以1μM三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO)为阳性参照,实时定量RT-PCR法检测PML/RARa融合基因及抗凋亡因子表达变化；(6) 12.5-200μg/ml PRF作用于NB4细胞48小时,以1μM为阳性参照,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达变化。【结果】体外实验提示：一定浓度范围内的PRF可有效抑制急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)细胞株—NB4细胞的增殖；Hoechst33258及瑞氏染色法表明：NB4细胞经过PRF处理后,形态出现凋亡特征；细胞周期检测发现：PRF可阻滞NB4细胞于S期,影响细胞周期进程；FITC-AnnexinV/PI双染法显示：NB4细胞的早期凋亡率呈现出时间-浓度依赖性；实时定量RT-PCR法显示：PRF可下调APL特定致病融合基因PML/RARa及抗凋亡基因Bcl-2、survivin的表达；蛋白印迹法发现：PRF可上调NB4细胞中JNK和FasL蛋白的表达,活化凋亡相关蛋白Caspase3和Caspase8;联合ATO处理后,上述变化更为显著。第二部分PRF体内对NB4细胞异种移植瘤裸鼠的影响[方法](1)NB4细胞以4×106/0.2 ml的浓度无菌接种于BALC/nude裸鼠右侧腋下,制成NB4细胞异种移植瘤裸鼠模型；(2)荷瘤裸鼠随机分为：不用药空白对照组、10mg/kg PRF组、20mg/kg PRF组、1.5mg/kgATO组及20mg/kg PRF+1.5mg/kg ATO联合组处理。每组8只；(3)PRF及ATO均以生理盐水稀释到相应浓度,按0.2ml/天/只,腹腔注射,共计2周；(4)观察荷瘤裸鼠包括瘤体体积、体重以及生存时间等指标的改变；病理切片HE染色检测肝脏、脾脏及移植瘤瘤体病理改变。[结果]体内实验提示：PRF一定程度上可抑制荷瘤裸鼠瘤体体积增殖,同时改善荷瘤裸鼠生活质量,延长荷瘤裸鼠生存周期。与ATO联合使用,发生协同效应。[结论]PRF体外诱导NB4细胞凋亡的效应极可能是通过活化JNK信号途径,从而激活促凋亡相关蛋白,并下调凋亡抑制因子和致病融合基因PML/RARa的表达等途径而实现的；RPF体内则可一定程度上改善NB4异种移植瘤裸鼠的生活质量。虽然这些结果在国内外尚未有其他报道,但我们有理由相信,PRF存在抗白血病的潜能,这也为PRF运用于AML/APL的临床研究奠定了实验基础。