泛素化是一种重要的蛋白翻译后修饰形式，它在真核生物的许多生理过程中发挥重要的调控作用，如蛋白降解，DN A损伤修复，免疫应答，信号传导，自噬，凋亡等。泛素化过程涉及三种酶，即E1泛素激活酶，E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。通过这三种酶的依次级联传递，最后把泛素分子连接到特异性底物蛋白上。其中E3泛素连接酶在这个过程中起关键性的特异性识别作用。　　目前已知的人类E3泛素连接酶约有600种，它们主要分为三大类：RING型（包括RING-like型，如U-Box和 PHD等）、HECT型以及RBR型。主要区别是RING型 E3调控泛素分子向底物的转移是直接的，HECT型需先转移到自身的活性半胱氨酸上，再转移至底物，是一个间接的过程。RBR型E3含有多个RIN G结构域，转移泛素机制与HECT型类似。LRSAM1属于RING-finger型E3泛素连接酶，拥有典型的C3HC4结构。全长LRSAM1拥有723个氨基酸，包含有一个LRR结构域，两个CC结构域，一个SAM结构域和一个与活性相关的RING结构域。RIN G结构域与其E3活性有关，但是对其它结构域的功能作用知之甚少。并且与其它E3蛋白相比，LRSAM1蛋白的结构，功能，活性调控，定位，信号传导等有待进一步深入研究。对LRSAM1分子自我活性调控研究是对后期一切功能和结构研究的基础，但是目前尚未有关LRSAM1蛋白的活性调控的报道。我们制备并纯化了LRSAM1的多克隆抗体，对其特异性和效价进行了评估，并用于后期活性调控实验。随后从其结构域入手，通过体外泛素化重组实验和哺乳细胞表达重组实验，分析了LRSAM1 E3活性调控过程。　　我们用原核表达系统表达并纯化了高纯度的不含冗余 tag的全长 LRSAM1蛋白作为抗原，免疫新西兰大白兔获得抗体血清。用溴化氰活化的琼脂糖交联LRSAM1抗原蛋白，通过亲和层析的方法纯化LRSAM1多克隆抗体，对其特异性进行检测表明其特异性良好，为后期实验研究奠定了基础。　　许多E3连接酶都能形成分子间的寡聚以调控其E3功能或者活性。通过戊二醛交联试验，我们发现 LRSAM1分子间也存在自缔结现象。体外实验中失活的LRSAM1ΔRING可以被野生型 LRSAM1WT识别并泛素化。细胞过表达两种标签的LRSAM1，可以通过IP证明LRSAM1的分子间相互作用。　　为寻找LRSAM1分子间相互作用的最小区域，通过分子间泛素化实验，我们发现LRR和 CC1结构域能被另一 LRSAM1分子泛素化。其中 LRR可被单泛素化而CC1可被多泛素化，LRR结构域含有13个保守的赖氨酸，但是它只发生了单一的泛素迁移带，为探明此单泛素化位点，我们构建了LRR的赖氨酸突变体，通过对13个赖氨酸突变体的泛素化情况分析，结果表明赖氨酸不是 LRR结构域的泛素化位点。最终通过两个独立的 N H2基团封闭实验表明 LRR结构域的单泛素化位点发生在N端的α-N H2上。　　对构建的LRSAM1氨基端缺失突变体的活性检测时发现，其N端串联的结构域有明显增强LRSAM1 E3活性的作用。当LRSAM1只保留其最小活性组件RING-finger结构域时，在相同浓度条件下，RING结构域的活性几乎检测不到，当其浓度提高至20倍时检测到泛素梯度带。当RING结构域与其N段结构域串联，其活性不断增强，并且LRSAM1ΔLRR和LRSAM1活性相当。　　体外实验中除分子间泛素转移被检测到外，我们还发现非活性LRSAM1蛋白的加入极大的减弱了与之重组的 LRSAM1蛋白的活性，但是对野生型和LRSAM1ΔLRR没有此种作用。为进一步探究是 LRSAM1蛋白的哪一部分结构调控了此种活性的下降，我们进一步构建了单个结构域突变体和多个结构域串联突变体，并用它们与含有RING结构域的活性突变体LRSAM1蛋白进行体外泛素化重组实验，其结果表明SAM或者CC2-SAM结构域的加入能显著减弱各种LRSAM1突变体的 E3活性，乃至对野生型的 LRSAM1蛋白也有明显的活性抑制作用。所以我们确定单独的 CC2-SAM结构有抑制 LRSAM1 E3活性的作用。考虑到LRSAM1ΔRING对野生型和 LRSAM1ΔLRR没有抑制作用，说明有某种结构能够拮抗CC2-SAM调控的抑制作用。通过串联突变体与 LRSAM1的体外重组实验，我们发现与CC2-SAM串联的CC1结构域能显著拮抗掉此种抑制作用，而不是单独加入的CC1结构域。最后我们在哺乳细胞中过表达底物蛋白TSG101和LRSAM1相关蛋白，研究LRSAM1对于底物的泛素化是否也受到相同的调控，得到了与体外一致的结论。　　综上所述，我们通过原核表达系统得到高质量的LRSAM1抗原蛋白，并对其多克隆抗体进行了制备，表明其拥有较好的特异性，并用于后续活性调控研究。虽然拥有LRR结构域的E3蛋白有一部分因其LRR的存在而自抑制，我们的结果表明，LRR结构域在LRSAM1 E3活性调控中没有自抑制作用。并且C端的RING-finger结构域与其 N端的结构域串联可以增大其 E3活性的功能。LRSAM1分子间通过自缔结形成寡聚，这促使了分子间泛素分子的转移，即LRSAM1蛋白能与自身其它分子相互识别并促使分子间泛素化的发生。在研究这种分子间泛素化调控时，我们发现CC2-SAM结构域的额外加入能显著抑制LRSAM1 E3活性，并且只有与CC2-SAM串联的CC1能拮抗此种抑制，而单独加入的CC1结构域则没有此种作用。同时我们发现 LRR结构域能通过分子间泛素分子的转移实现 N端的单泛素化。