表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidia，SE)生物膜的形成导致细菌顽固附着于高分子医用材料表面，难以清除，降低细菌对药物的敏感性，保护细菌抵御机体天然免疫，造成慢性反复感染难以彻底治愈，手术取出植入物以彻底清除感染灶是唯一有效治疗手段。因此，深入研究表皮葡萄球菌生物膜形成的相关毒力基因，对于研究其致病的分子机制并寻找有效治疗药物和方法有重要的意义。本实验室与国家人类基因组南方研究中心合作完成生物膜阴性SEATCCl2228株全基因组测序分析，通过与生物膜阳性SEATCC35984株基因组比较发现，SEATCCl2228株中存在ica操纵子的缺失。李华林博士等通过基因导入技术将ica操纵子导入生物膜阴性SEATCCl2228株中，使之获得生物膜形成能力，并经动物实验证实生物膜的形成使SEATCCl2228株毒性加强，证实ica操纵子在生物膜的形成中的关键作用。 本研究运用生物信息学方法对生物膜形成SEATCC35984株ica操纵子中各个基因的功能和作为新型抗菌药靶的潜在性进行探讨，选择／caA基因编码糖基转移酶蛋白(GT-IcaA)为首选药物筛选靶点，对筛选所得候选小分子化合物生物学功能予以验证并初步探讨其作用机制，通过同源重组基因敲除技术构建表皮葡萄球菌icaC基因缺失突变株并研究其缺失对生物膜形成的影响及机制，尝试利用大肠杆菌(E.coli)表达系统对ica操纵子功能基因重组表达，以期为后续研究奠定基础。 第一部分表皮葡萄球菌ATCC35984株ica操纵子的生物信息学分析 我们运用核苷酸和氨基酸序列比对、蛋白质结构域分析及二级结构预测等生物信息学方法对ica操纵子的一个调节基因和4个功能基因分别进行分析并结合已报道研究结果分别探讨各个基因在细菌生物膜形成中的作用及作为药靶的潜在性。icaR基因产物属于四环素家族抑制子，通过调节ica操纵子转录参与环境因素等对细菌生物膜形成的影响，N端DNA结合区序列与家族成员高度同源，通过二级结构预测和比较发现结构特征一致。其作用机制为与相关因子结合导致IcaR蛋白二聚体构象改变，无法与／ca操纵子功能基因转录起始区结合而起始转录，不宜作为药物筛选靶点。／caA基因编码产物含糖基转移酶家族2(GlycosyltransferaseFamily2，GT2)结构域，尽管序列间同源性较差，但经二级结构预测、比较发现存在相似的结构特征，并在相应位置定位得到功能相关DXDmotif。icad编码产物是糖基转移酶活性必需蛋白，但是序列分析未发现存在已知功能结构域，因而尚无法了解作用机制。两个蛋白协同表现酶活性是目前糖基转移酶家族中所特有，且其基因编码产物催化合成的p．1,6-N-乙酰葡糖胺较为少见，因此GT-IcaA具有作为药物筛选靶点潜在性。icaB基因编码产物含脱乙酰基酶结构域，二级结构预测与比较分析发现虽然具有相似的结构特征，但是仅在相应位置定位得到2个完全一致的功能相关保守氨基酸位点。icaB基因编码产物参与多糖粘附因子(Polysaccharideintercellularadhesion，PIA)糖链修饰并影响其生物学功能，且是ica操纵子功能基因产物中唯一的分泌蛋白，具有作为药物筛选靶点潜在性。icaC基因编码产物是形成长链多糖粘附因子糖链所必须，功能未知。序列比对分析未发现存在已知功能结构域，无法了解其作用机制，不宜作为药物筛选靶点。 综合生物信息学分析结果，GT-IcaA和IcaB脱乙酰基酶结构域都具有药物筛选靶点的潜在性。鉴于icaA编码产物是多糖粘附因子糖链合成的关键，也是IcaB编码产物发挥其糖链修饰功能的前提，我们首选GT-IcaA蛋白为药物筛选靶点。 第二部分GT-IcaA蛋白作为潜在抗菌药靶的研究 在通过第一部分的生物信息学分析，选定SEATCC35984株GT4caA蛋白为首选药物筛选靶点后，我们与中国科学院上海药物研究所合作，对GT-IcaA蛋白进行三维结构模建及虚拟高通量筛选小分子化合物，并最终购得63个候选小分子化合物。 经过最小抑菌浓度实验(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)、最小杀菌浓度实验(MinimalBactericidalConcentration，MBc)和生物膜半定量检测等实验验证，63个候选小分子化合物中，4个抑制细菌生长(13＃、20＃、25＃、30＃)；8个单纯抑制细菌生物膜形成(1＃、5＃、10＃、11＃、23＃、28＃、35＃、41＃)；并且其中3个(20＃、30＃、1＃)可影响成熟细菌生物膜，降低生物膜中的细菌。在上述12个小分子抑制物中，3个(5＃、10＃、28＃)对Vero(绿猴肾细胞系)毒性较小，其它毒性较大。通过WGA植物凝集素(Lectin)结合实验检测多糖粘附因子组成N．乙酰-β-D-葡萄糖胺，发现l＃、l＃、11＃和23＃小分子抑制物处理后，N-乙酰-β-D-葡萄糖胺含量低于对照组。尝试运用高效液相色谱联用荧光检测器建立体外检测糖基转移酶活性的方法，以期更直接研究上述GT-IcaA潜在小分子抑制物作用机制，但尚未成功，体外检测糖基转移酶活性的方法还有待继续改进。 第三部分表皮葡萄球菌1457icac基因突变株的构建及其对生物膜形成的影响 表皮葡萄球菌ica操纵子功能基因编码产物参与合成多糖粘附因子，其中icaC基因是形成长链多糖的必需基因，但不影响糖基转移酶活性，其功能至今尚未见报道。 我们采用大肠杆菌一表皮葡萄球菌穿梭质粒pBT2，首先于大肠杆菌DH5a中构建同源重组质粒，将icaC基因上、下游序列接入pBT2载体中，并于上、下游序列间插入红霉素抗性基因(ermB)作为突变株筛选标记。然后将构建所得并经金黄色葡萄球菌(Staphlylococcusaureus，S.aureus)RN4220株修饰的同源重组质粒pBT2.AicaC转化入SEl457株，利用质粒高温下存在复制缺陷等特性，经过于低浓度红霉素及40℃条件下连续传代40天，通过抗性筛选得到SEl457icaC基因敲除突变株(SEl457Z～icaC株)，并对SEl457zS～icaC株进行PCR和基因重组区测序等方法验证。比较SE1457株和AicaC株，发现icaC基因的缺失对细菌生长和生化反应无明显影响，但使生物膜形成明显降低，并且通过采用美国国立卫生研究院(NIH)MichealOtto博士惠赠的兔抗表皮葡萄球菌多糖粘附因子抗血清斑点免疫印迹法和WGA植物凝集素结合实验分别检测野生株和AicaC株细菌细胞外洗脱物中多糖粘附因子和N．乙酰-β-D-葡萄糖胺的含量，发现在AicaC株中均降低。 第四部分表皮葡萄球菌ATCC35984株ica操纵子功能基因的重组表达 随着上述三部分研究的进行，我们尝试利用大肠杆菌原核表达系统对／ca操纵子功能基因进行重组表达，以期得到纯化蛋白，为深入研究其功能机制提供帮助。 我们选用了pET28-a、pQE-8lL、pMAL-c2X及pBAD／TOPO(R)ThioFusion四种原核表达载体，分别构建／ca操纵子功能基因表达质粒。最终得到／caA(A-pET、A-pMAL、A-pBAD)、／caA糖基转移酶结构域(GT-icaA)(GT-icaA—pET、GT-icaA—pQE、GT-icaA—pMAL、GT-icaA—pBAD)、icad(D-pET、D-pMAL、D-pBAD)、icaB(B-pBAD)和icaC(C-pET)共12个表达质粒，但是仅GT-／caA-pMAL和GT-icaA-pBAD表达质粒可在大肠杆菌中被诱导表达，得到目的蛋白。利用麦芽糖结合蛋白(MaltoseBindingProtein，MBP)可与多糖树脂(AmyloseResin)结合并被麦芽糖置换地特性，纯化得到MBP-GT-IcaA蛋白。为了得到GT-IcaA蛋白，采用蛋白酶FactorXa酶切MBP-GT-IcaA蛋白，但是酶切后的GT-IcaA蛋白降解迅速，无法纯化。以MBP-GT-IcaA融合蛋白免疫Balb／c小鼠(雌性，6周龄)制备抗血清，经斑点免疫印迹法和Western免疫印迹法检测，所得抗血清对GT～IcaA蛋白的效价远低于对MBP蛋白的效价，且MBP蛋白常见于原核生物中，因此抗血清不宜用于检测细菌IcaA蛋白。