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2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)作为维生素C的前体,工业上由L-山梨糖在酮古龙酸菌及芽孢杆菌组成的混菌发酵体系转化获得。虽然经过多年的菌种优化,但是各工业菌种生产2-KGA的能力提高不显著,其代谢途径尚不完全清楚。本文对实验室现有的两株酮古龙酸菌Ketogulonigenium vulgare SPU_B805(需要Bacillus megatherium SPU_B806伴生共发酵)及Ketogulonigenium robustum SPU_B003(可独立发酵)进行了全基因组测序,并与已报道的需要伴生发酵的四个菌株(K.vulgare WSH-001、K.luare Y25、K.vulgare Hbe602及K.vulgare SKV)进行比较基因组学分析,以揭示生长模式及产量不同的机制。K.vulgare SPU_B805只含有一个环状的基因组,没有质粒,缺失葡萄糖酸2-脱氢酶(分解2-KGA,GA2DH)基因、山梨酮脱氢酶(转化山梨酮为2-KGA,SNDH)、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶(ED途径关键酶,EDA)和磷酸葡糖酸脱水酶(ED途径关键酶,EDD)。分析发现,K.vulgare SPU_B805缺少6-磷酸果糖激酶(pfk,EMP关键途径基因)及edd和eda基因(ED途径关键基因),所以糖代谢主要通过磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)和三羧酸循环(citric acid cycle,TCA)进行。同时,其氨基酸生物合成途径比其他已报道的2-KGA产生菌完整,仅缺失合成组氨酸、丙氨酸和天冬酰胺3个氨基酸的4个关键酶(组胺醇磷酸酶、亮氨酸-丙氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶及天冬酰胺合成酶)。所有上述因素均有利于K.vulgare SPU_B805菌体生长及2-KGA积累。另外,K.robustum SPU_B003中tRNA、rRNA、NAD和NADPH基因、调控和细胞信号系统基因、参与细胞内物质交换、分泌和膜泡运输的基因数量均高于K.vulgare,推测是其能独立生长及产酸的主要原因。代谢途径分析显示K.robustum SPU_B003主要通过PPP、ED和TCA途径进行糖的分解代谢。为了在K.robustum SPU_B003中进行基因表达的操作,首先用BPROM及phiSITE预测自身内源性启动子,获得PtufB、P1、P2及P3;在它们下游连接egfp步基因转化不同菌种检测启动子启动基因表达的能力,发现在K.robustum SPU_B003及K.vulgare SPU_B805中,启动子活性由强到弱为P1>P2>PftufB>P3;在Pseudomonas putida KT2440中为P1>P3>P2>PtufB;在Paracoccus denitrificans PD1222中为P3>P2>P1>PtufB;在Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli C43(DE3)及Bacillus subtilis中,启动子P1活性最强;在Raoultella ornithinolytica中启动子P2活性最强。由此可见,启动子P1在K.robustum SPU_B003、K:vulare SPU_B805、P.putida KT2440、E.coli BL21(DE3)、E.coli C43(DE3)及B.subtilis中均展现出最强的活性,且不易受遗传背景影响,具有广宿主性。在K.robustum SPU_B003中,己糖经PPP途径生成乙酰辅酶A伴随着两步脱羧,分别是6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)催化6-磷酸葡萄糖酸生成5-磷酸核酮糖(Ru5P)及丙酮酸脱氢酶(PDH)催化丙酮酸生成乙酰辅酶A,产生的二氧化碳释放到环境中造成碳利用率下降,2-KGA转化率降低。为了降低碳损失,在K.robustum SPU_B003中异源表达磷酸转酮酶(XFP)和磷酸转乙酰酶(PTA),并优化了xfp和pta基因的密码子,构建XFP-PTA糖代谢途径。重组菌K.robustum/pBBR-P1_xfp2502-P2_pta2145胞内乙酰辅酶A含量是对照组K.robustum/pBBR1MCS-2的2.4倍,生物量提高了17.27%,2-KGA产量提高了6.90g/L,即21.09%;同时其体内pgd及pdh基因的转录水平分别降低了24.33±6.67%和8.67±5.51%,山梨糖脱氢酶(SDH)及山梨酮脱氢酶(SNDH)基因的转录水平有不同程度的提高。由此可见,重构的XFP-PTA代谢途径能提高K.robustum SPU_B003胞内乙酰辅酶A含量,降低碳损失,提高生物量及2-KGA产量。