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第一部分MEF饲养层对小鼠胚胎干细胞(MES)的支持效果实验一小鼠成纤维细胞(MEF)的制备目的制作原代小鼠成纤维细胞(MEF),为小鼠胚胎干细胞(MES)饲养层做准备。方法将雌、雄昆明小鼠2:1合笼,取妊娠12~18d孕鼠,无菌取出胎鼠。去除胎鼠头尾四肢内脏,PBS清洗数次后,剪碎组织,胰蛋白酶消化细胞,进行原代细胞培养,并按常规方法传代、冻存。结果前三代小鼠成纤维细胞中杂细胞(非成纤维细胞)较多,细胞形态多样。随着传代次数的增加,细胞形态逐渐一致,细胞连接成片,细胞之间连接紧密、界限不清。大部分细胞的胞质有2~3个突起,呈梭形,少数为圆形或不规则性。细胞胞体中间部分即细胞核所在的部位稍稍隆起,细胞轮廓清晰、立体感较强。细胞质内颗粒很少,细胞较为透明。实验二MEF饲养层的制备目的制备MEF饲养层,为小鼠ES的培养做准备。方法取对数期生长期的MEF,用终浓度10μg/ml丝裂霉素C处理2h。PBS充分洗涤五次。消化细胞调整浓度为0.5x106个/ml,均匀种植到经过0.1%明胶包被的6孔板里。结果MEF饲养层细胞经过丝裂霉素C处理以后,种植到6孔板,2~3d后细胞融合成片,连接紧密单层生长。倒置显微镜下观察,与药物作用之前相比,MEF细胞数量略有减少,细胞形态没有发生明显的变化,细胞大多呈梭形,大小一致,排列规则、边界清楚。选择适当的丝裂霉素C浓度和作用时间对饲养层的制作很关键。用浓度为10μg/ml的丝裂霉素C对MEF处理2h,饲养层细胞不再增殖同时保持良好的生存状态。MEF细胞经过丝裂霉素C处理以后,1~2w左右会衰退死亡。实验三小鼠ES细胞在MEF饲养层上的生长特征目的观察小鼠胚胎干细胞(ES)在MEF饲养层上的生长情况。方法选取的丝裂霉素C处理过的原代小鼠成纤维细胞(MEF)饲养层细胞,吸弃饲养层培养液,换用专用的小鼠胚胎干细胞(ES细胞)培养液,取ES细胞5x105个,均匀种植到饲养层细胞的表面。结果胚胎干细胞(ES)接种到MEF饲养层两天后细胞聚集生长形成ES克隆。克隆逐渐增大,隆起生长,呈岛屿状。克隆边缘清楚,结构致密,与周围的饲养层细胞界限清楚。实验四MEF饲养层上的ES细胞分化情况的观察目的观察胚胎干细胞在饲养层上分化情况。方法1.碱性磷酸酶(AKP)染色将两种饲养层上的胚胎干细胞用PBS洗三次,用4%的多聚甲醛溶液室温下固定10min,再用PBS洗三次,加入NBT/BCIP作用20-30min,倒置显微镜下观察显色情况,适时流水中止反应。2. OCT-4检测采用免疫荧光法染色技术。室温下用正常驴血清(用PBS按1:10稀释)封闭ES上的非特异特异性抗体。加入OCT-4抗体(用PBS按1:500稀释)于4°°°C CC孵育过夜。PBS多次洗涤以后,加入荧光标记的驴抗兔二抗于室温下孵育1h,PBS多次洗涤后,50%甘油封片。结果免疫荧光法检测ES细胞上OCT4的表达,MEF饲养层上的ES细胞克隆发出绿色荧光。MEF饲养层上的ES细胞克隆碱性磷酸酶(AKP)染色呈紫蓝色。实验结果表明MEF饲养层上的ES细胞仍处于未分化状态,MEF饲养层可以维持胚胎干细胞的多分化潜能,保持其未分化状态。第二部分人胎肺成纤维细胞(hLEF)饲养层对小鼠胚胎干细胞(ES)的支持效果实验一hLEF的丝裂霉素最佳浓度的选择目的选择合适的丝裂霉素浓度,为人胎肺成纤维细胞(hLEF)饲养层做准备。方法消化培养细胞,调整细胞浓度,接种于96孔板中,37 oC、5%CO2培养培养24h。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)100μL,继续孵育4h,吸弃培养液,加入DMSO150μL,震荡10min。利用酶标仪492nm波长下比色测定OD值。结果不同浓度的丝裂霉素C,作用不同的时间,对人胎肺成纤维细胞(hLEF)产生的抑制细胞增殖的效果不同。随着药物作用时间的延长和药物浓度的增加,药物对hLEF的增殖抑制作用增强。用浓度为5μg /ml的丝裂霉素C作用1.5h就可以对hLEF产生一定的抑制作用但细胞仍然有明显的增殖现象。用10μg/ml的丝裂霉素C处理细胞1.5~3.5h或者20μg /ml的丝裂霉素C处理细胞1.5h均可以保持hLEF细胞不再增殖也不会死亡。这是丝裂霉素C对人胎肺成纤维细胞(hLEF)的最佳处理浓度和作用时间范围。当丝裂霉素C的浓度过低(<10μg /ml)不能有效的抑制hLEF的增殖。而丝裂霉素C浓度过高(>20μg/ml),同时作用的时间又过长(>1.5h)则会引起hLEF细胞死亡。实验二hLEF饲养层的制备目的制备hLEF饲养层,为小鼠ES的培养做准备。方法取对数生长期hLEF,用终浓度10μg/ml丝裂霉素C处理2.5h。PBS充分洗涤五次。消化细胞调整浓度为0.5x106/ml,均匀种植到经过0.1%明胶包被的6孔板里。结果经丝裂霉素C处理过的hLEF细胞迅速融合成片,连接紧密单层生长。倒置显微镜下观察细胞大多呈梭形,胞体透明、大小一致,排列规则、边界清楚。选择适当的丝裂霉素C的浓度和作用时间对饲养层的制备很关键。本实验中选择了浓度为10μg/ml的丝裂霉素C对hLEF的处理2.5h, hLEF饲养层细胞不再增殖同时保持良好的生存状态。丝裂霉素C处理过的hLEF细胞大约可以存活2~3w。实验三小鼠ES细胞在hLEF饲养层上的生长特征目的观察小鼠胚胎干细胞(ES)在hLEF饲养层上的生长情况。方法选取状态良好的的胚胎干细胞种植到hLEF饲养层细胞,吸弃饲养层培养液,换用专用的小鼠胚胎干细胞(ES细胞)培养液,取ES细胞5x105个,均匀种植到饲养层细胞的表面。结果胚胎干细胞(ES)接种到hLEF饲养层后第二天观察细胞,ES克隆散在分布在饲养层细胞表面,ES克隆很小呈现一个个小圆点,凸起尚不明显。2~3d后克隆逐渐增大,ES细胞克隆呈现集落状(岛屿状)隆起生长,边缘清楚,结构致密,形成的克隆细胞之间的界限不明。同样的培养条件下,培养同样的天数,与MEF饲养层上的ES细胞克隆相比,hLEF饲养层上的ES细胞克隆生长较慢,克隆较小,不饱满。实验四hLEF饲养层上的ES细胞分化情况的观察目的检测hLEF饲养层是否可以维持ES细胞的未分化状态。方法1.碱性磷酸酶(AKP)染色将两种饲养层上的胚胎干细胞用PBS洗三次,用4%的多聚甲醛溶液室温下固定10min,再用PBS洗三次,加入NBT/BCIP作用20-30min,倒置显微镜下观察显色情况,适时流水中止反应。2. OCT4检测采用免疫荧光法染色技术。室温下用正常驴血清(用PBS按1:10稀释)封闭ES上的非特异特异性抗体。加入OCT4抗体(用PBS按1:500稀释)于4°°°C CC孵育过夜。PBS多次洗涤以后,加入荧光标记的驴抗兔二抗于室温下孵育1h, PBS多次洗涤后,50%甘油封片。结果hLEF饲养层上的胚胎干细胞OCT4检测为阳性。荧光显微镜下观察,ES细胞克隆发出绿色荧光。胚胎干细胞的AKP染色后,ES克隆被染成紫蓝色。说明hLEF饲养层可以代替MEF饲养层维持ES细胞的生长状态,保持胚胎干细胞处于未分化状态。