研究背景:甲状腺癌是内分泌器官中最常见的恶性肿瘤,主要病理类型有甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、滤泡癌、未分化癌和髓样癌等。其中PTC最为常见。一般而言,PTC发展缓慢,病程较长,预后较好,但也有很多PTC患者因没有临床症状,就诊较晚,一经发现,即伴随有淋巴结转移、被膜侵犯等情况,导致患者的预后不佳;故仍需要早发现、早诊断、早治疗PTC。尽管多数文献报道,PTC的发病机制与BRAF基因突变、RET/PTC基因重排等有关,但目前有关PTC的发病机制仍未完全明确,因此深入研究PTC的发病机制有着重要的临床意义。哺乳动物细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是机体内最主要的氧化还原酶,由8种GPX组成,分别命名为GPX1-GPX8,其中GPX1-GPX4以及GPX6为含硒代半胱氨酸的GPXs,GPX5、GPX7及GPX8则为非含硒代半胱氨酸的GPXs。通常,含硒代半胱氨酸的GPXs能够通过催化还原型谷胱甘肽(GSH)来还原H2O2,以达到降低疾病氧化应激反应的作用。而非含硒代半胱氨酸的GPXs,不同于含硒代半胱氨酸的GPXs,其缺少GSH结合结构域,因此,它们引起过氧化物酶活性的机制还存在争议。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)包括氧离子和过氧化物等活性含氧分子,是机体正常代谢产生的内在产物。有学者提出氧化应激反应与肿瘤的发生、发展有关。所谓的氧化应激反应是指机体遭受有害刺激时,体内的ROS产生过多,使机体氧化程度超出氧化物的清除,使得氧化系统与抗氧化系统失衡而引起的组织损伤。ROS包括O2-、H2O2、HO2-、-OH等的活性含氧分子。长期持续的氧化应激,会导致自身免疫异常、肿瘤发生、糖尿病、肥胖、神经变性和衰老等等多种疾病。甲状腺的主要生理功能是合成甲状腺激素,其中的h2o2作为甲状腺激素合成的关键酶-甲状腺过氧化物酶的必需底物,对甲状腺激素合成及发挥正常甲状腺生理功能起到非常重要的作用。当机体发生异常时,h2o2可在甲状腺中过度蓄积,使得甲状腺持续暴露在高浓度的h2o2及其附带效应产生的ros环境中,即氧化应激反应中,使甲状腺细胞受到氧化性dna损伤或基因低甲基化。已有研究证实,大量的ros可促进自身细胞的增殖、侵袭、转移及血管生成,并能逃避凋亡的发生。因此,氧化还原反应的异常可能与ptc的发生、发展有关。gpx7是gpxs家族成员之一,主要参与维持机体的氧化还原稳态的作用。近年来研究发现,gpx7异常表达与多种肿瘤(包括食管腺癌、乳腺癌、肝细胞癌等)的发生、发展相关,但有关gpx7在甲状腺癌中的研究尚未见报道。已知nf-κb是一种存在于真核细胞中控制dna转录的重要核转录因子,具有多向转录调节作用,已证实nf-κb与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。有文献报道gpx7在食管腺癌(eac)中的作用有可能是通过nf-κb信号通路来发挥作用的。cyclind1能够正性调控细胞周期,是检测细胞增殖活性的指标之一,有报道cyclind1是nf-κbp65的重要下游靶基因。有关gpx7在甲状腺乳头状癌中与nf-κb、cyclind1表达关系的研究,尚未见报道。因此,本研究目的是从组织和细胞水平分别研究gpx7在ptc中的表达,以及与ptc临床病理参数的关系,探讨gpx7在ptc发生、发展过程中的作用及可能机制,为进一步研究gpx7在甲状腺乳头状癌中的作用机制奠定基础。目的:1、从组织和细胞水平研究gpx7在ptc中的表达情况及对ptc细胞增殖和凋亡的影响,探讨gpx7在ptc发生、发展中所起的作用。2、从组织和细胞水平分别研究gpx7与nf-κbp65、cyclind1表达的关系,探讨gpx7参与调控ptc细胞增殖与凋亡的可能机制。3、研究gpx7蛋白在伴有桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌(ptc+ht)组织中的表达,探讨桥本甲状腺炎的炎性微环境对gpx7表达的影响,为进一步研究gpx7在甲状腺乳头状癌中的作用机制奠定基础。方法:1、用免疫组织化学方法检测30例ptc、14例结节性甲状腺肿(结甲)组织中gpx7蛋白的表达情况,并分析gpx7与临床病理特征的关系。2、构建gpx7基因干扰慢病毒载体,用westernblot方法外源验证靶点有效后,用构建成功的gpx7基因干扰慢病毒载体感染甲状腺乳头状癌(k1)细胞,使用qt-pcr的方法检测基因敲减效果;并用多种细胞功能实验(celigo细胞计数、流式细胞仪检测、caspase3/7检测、mtt检测、细胞克隆形成实验)方法,观察gpx7基因敲减与未基因敲减的k1细胞的细胞增殖、凋亡、克隆形成的差异。3、用免疫组织化学方法检测30例ptc、14例结节性甲状腺肿(结甲)组织中nf-κbp65、cyclind1蛋白的表达情况,分析各指标与gpx7表达的关系。4、用gpx7基因干扰慢病毒载体感染k1细胞,并用westernblot方法检测gpx7基因敲减前后nf-κbp65、cyclind1蛋白表达情况。5、用免疫组织化学方法检测29例伴有桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌(ptc+ht组)、31例甲状腺乳头状癌(ptc组)、16例桥本甲状腺炎(ht组)以及14例结节性甲状腺肿(结甲组)组织的gpx7表达情况,结合临床病理参数,探讨桥本甲状腺炎的炎性微环境对gpx7表达的影响及在甲状腺乳头状癌中所起的作用。6、免疫组化评判标准:每例均随机观察5个高倍视野,根据染色细胞百分率和染色强度进行评定和分析。阳性细胞百分率计分标准:<10%为0分,11%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分;染色强度计分:无染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。将阳性细胞率得分和染色强度得分相乘即为最后得分,0分为阴性(-),1~4分为弱阳性(+),5~8分为中度阳性(++),9~12分为强阳性(+++)。7、统计学方法:采用spss20.0统计软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差表示,组间差异比较采用独立样本t检验,如方差不齐则采用t’检验。计数资料采用例(百分率)表示,组间比较采用卡方检验。相关性分析采用pearson相关性分析。p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1、gpx7对甲状腺乳头状癌细胞增殖、凋亡影响的研究(1)免疫组化结果:(1)gpx7表达于甲状腺细胞胞质中。gpx7在ptc组表达阳性率为100.0%,以中-强阳性为主;结甲组gpx7表达表达阳性率为30.0%,以弱阳性为主,ptc组gpx7表达明显高于结甲组(p<0.05)。(2)gpx7的表达与肿瘤最大径呈正相关关系(r=0.601,p<0.05),且gpx7高表达组肿瘤最大径(1.56±0.56cm)明显大于gpx7低表达组(0.56±0.13cm)(p<0.05)。(2)细胞实验结果:(1)选取两种人甲状腺乳头状癌细胞系tpc-1和k1。qt-pcr结果显示gpx7基因在tpc-1和k1细胞中都有较高的表达丰度。相比较k1细胞表达丰度更高,故选取k1细胞进行后续实验研究。(2)gpx7基因干扰慢病毒载体制备后,采用westernblot外源验证,发现gpx7基因敲减后gpx7的表达明显减少,说明靶点对gpx7基因的外源表达有敲减作用,是有效靶点。(3)gpx7基因干扰慢病毒载体感染k1细胞后通过普通显微镜和荧光显微镜下观察,发现细胞感染效率达到80%以上,且细胞状态正常,采用qpcr的法证实经shrna慢病毒感染后,k1细胞中gpx7基因在mrna水平的表达量受到抑制,敲减效率达到81.5%,说明载体感染k1细胞效果好,可以进行后续的实验观察。(4)celigo细胞计数结果显示,gpx7基因敲减组细胞增殖数明显减少,培养第5天较第1天仅增殖(5.00±0.32)倍,与对照组的(8.44±0.26)相比较,增殖速率明显减慢。(5)流式细胞仪检测发现,gpx7基因敲减组细胞凋亡百分比(24.08±0.28)%,与对照组的(4.33±0.15)%相比较,凋亡比例明显增多。(6)caspase3/7活性检测发现,gpx7基因敲减组的caspase3/7活性值为(257.82±21.28),与对照组的(100.00±5.38)相比较,明显增加。(7)mtt检测发现,gpx7基因敲减组培养第5天od490值较第1天增长(3.081±0.160)倍,与对照组(增长4.897±0.091倍)相比较,gpx7基因敲减组细胞增长倍数明显减少。(8)细胞克隆形成检测实验发现,gpx7基因敲减组克隆形成数(283±6)与对照组克隆形成数(710±10)相比较,明显减少。2、gpx7在甲状腺乳头状癌中的可能作用机制(1)免疫组化结果(1)nf-κbp65表达于甲状腺细胞胞质和(或)细胞核中。ptc组表达明显高于结甲组。ptc组nf-κbp65的阳性表达率达83.3%,以中度阳性为主。(2)cyclind1表达于甲状腺细胞核。ptc组表达明显高于结甲组。ptc组cyclind1阳性表达率达到96.7%,以中度阳性为主。(3)gpx7、nf-κbp65、cyclind1蛋白表达呈显著正相关(r值分别为0.721、0.589、0.703,p值均<0.05)。(4)ptc组gpx7与nf-κbp65联合检测阳性率为83.3%,与cyclind1联合检测阳性率为100.0%,三者联合检测阳性率为83.3%。(2)细胞实验结果(1)慢病毒感染目的细胞效率较高,qpcr证实gpx7基因被有效敲减。(2)westernblot实验结果显示,敲减甲状腺乳头状癌细胞(k1细胞系)的gpx7基因后,nf-κbp65蛋白表达量无明显变化,cyclind1蛋白表达量增高,与敲减前比较,差异有统计学意义(p<0.05)。3、炎性微环境对gpx7在ptc中表达的影响结果(1)免疫组化结果显示,伴桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌组织gpx7蛋白表达评分(6.21±2.29)低于甲状腺乳头状癌(8.52±2.41),差异有统计学意义(p<0.05)。(2)单因素分析发现影响gpx7表达的因素有合并ht、tg-ab、tpo-ab、肿瘤部位和被膜侵犯情况,其中gpx7与合并ht、tg-ab和tpo-ab水平呈负相关,与肿瘤部位、被膜侵犯情况呈正相关。(3)多因素线性回归分析发现影响gpx7表达的因素为有合并ht。(4)临床病理特征分析,发现合并ht炎性环境的ptc肿瘤多局限于单侧,被膜侵犯发生率低。结论:1、免疫组化和细胞实验结果显示GPX7在甲状腺乳头状癌中高表达。2、免疫组化和细胞实验结果提示GPX7具有促进甲状腺乳头状癌细胞增殖、减少细胞凋亡的作用。3、GPX7、NF-κB p65、Cyclin D1蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达呈正相关,提示三者在甲状腺乳头状癌的发生、发展中可能有关联。4、GPX7基因敲减后NF-κB p65蛋白表达无变化,提示GPX7对甲状腺乳头状癌的作用与NF-κB信号通路无关或不是通过调节其蛋白表达量来实现的。5、GPX7基因敲减后Cyclin D1蛋白表达增高,机制不清。6、通过单因素和多因素线性回归分析,发现是否合并桥本甲状腺炎是影响甲状腺乳头状癌组织中GPX7表达的因素,提示桥本甲状腺炎的炎性环境能抑制甲状腺乳头状癌组织中GPX7的表达。