多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）是中枢神经系统慢性炎症脱髓鞘性疾病，具有复发、迁延及致残率高等特点，但确切发病机制尚不清楚。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)是MS在啮齿类动物身上的模拟模型，可以用来研究MS的发病机制以及药物治疗。由于多发性硬化症的机制不明，一直缺乏有效的治疗药物，因此急需明确的机制研究和有效新药开发。我们课题组前期对旋覆花属植物进行研究，提取分离得到一个倍半萜内酯化合物大花旋覆花内酯（Britanin），有文献充分表明这类化合物具有明确的体外抗炎活性，我们前期的抗一氧化氮（NO）生成筛选也表明其具有十分明显的活性。我们将Britanin用于EAE小鼠的防治中，发现给以50mg/kg/天的剂量灌胃可以显著延迟小鼠的发病时间，降低小鼠的发病程度。尽管前期也进行了一些机制方面的研究，但是对Britanin的作用机制还很不清楚。本课题用亲和色谱的方法来寻找Britanin防治EAE的作用靶标，以此来揭开其作用的机制和靶标。首先对Britanin进行结构修饰，设计并合成了两个生物素标记的产物BX-4和BX-8作为亲和色谱的探针，探针的化学结构经过质谱和核磁共振进行确证，纯度经高效液相色谱进行分析，均符合要求。另外，在合成过程中对探针的合成路线进行探索，找到了一条快速简便的合成路线，可以快速地得到产物。探针的活性评价通过用抑制NO生成的实验来进行的，结果显示BX-4、BX-8与Britanin（IC50=0.74μM）相比，活性均有一定程度的下降，其IC50值分别为5.82μM和23.00μM，活性分别下降了8倍和31倍，但是其在5μM和10μM浓度下依然能够显著抑制NO的生成，具有统计学意义，表明探针仍然可以使用。同时发现生物素与连接基团对Britanin活性的较大影响，而水溶性的连接基团影响更大。另外，细胞毒实验结果显示，虽然BX-4在较高浓度下具有细胞毒性，但是其在5μM和10μM浓度下基本没有细胞毒性，而BX-8较高浓度下也没有明显的细胞毒性。进一步排除了细胞毒性对化合物抗炎活性评价的影响。在使用合成的生物素化探针进行亲和色谱研究之前，我们先采用CNBr-activatedSepharose4B和Epoxy-activated Sepharose6B这两种特殊活性的树脂进行探索，根据Britanin结构上的羟基可以与这两种树脂偶联的原理进行操作。最后发现固定相载体上的连接基团过短的CNBr-activated Sepharose或者是带有一水溶性的连接基团的Epoxy-activated Sepharose6B均不能获得一个较好的试验结果，提示连接基团在本研究中的重要性。生物素法是利用磁珠表面包被的亲和素与探针上的生物素可以高亲和力地结合的原理，将探针固定于磁珠表面并与靶细胞蛋白裂解液充分孵育，经过多次洗涤除去非特异性结合蛋白之后，用变性的条件洗脱获得结合蛋白，再利用凝胶进行蛋白分离。我们从凝胶分离的结果中，找到了8个特异性条带，并选择其中差异最大的5个条带进行质谱鉴定。我们从中鉴定的蛋白中挑选了几个感兴趣的蛋白：TNF受体相关因子-2和NCK相互作用蛋白激酶（TNIK），丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N2（PKN2），Ras相关C3肉毒梭菌毒素底物蛋白（Rac-2），髓鞘碱性蛋白,钙调蛋白,蛋白MICAL-2分别进行验证。我们用激酶实验测试Britanin对TNIK和PKN2这两个激酶的活性，从计算机模拟（docking）的结果上来看Britanin结构上的-次甲基-γ-内酯基团可以与激酶的活性位点进行很好对接。实验采用的是ATP竞争法，ATP浓度分别为9μM和20μM，结果显示Britanin对这两个激酶活性均很低，其IC50值均大于10μM，提示Britanin与这两个激酶并没有相互作用，或者相互作用较弱。从蛋白条带8的蛋白质组比较中又发现了一个令我们感兴趣的蛋白，波形蛋白（vimentin），该蛋白作为一个细胞骨架蛋白在近来的研究中发现其与炎症的发生和免疫反应相关，又是EAE发病的一个标志物。我们用蛋白质印迹验证了该蛋白，用Britanin作为竞争竞争剂能够使该条带消失，因此认为vimentin可能与Britanin可能存在相互作用，可能是其作用的靶标，但是具体的相互作用方式以及生物学功能还需要进一步的验证。本研究预期为EAE的防治提供有效的小分子，为EAE的发病机制提供更多理论基础，为倍半萜内酯的抗炎作用机制提供更多证据。