埃博拉病毒是一种可在人及非人灵长类动物间通过接触传播的一类病原微生物,致死率高达90%。埃博拉病毒有高防护、难获取的特点,目前世界上大多数国家没有埃博拉病原,更没有资源、条件开展埃博拉病毒的相关研究。此外,有关埃博拉病毒的药物筛选与评价工作还要依靠高等级生物安全实验室进行,实验过程存在较高生物安全风险,并且成本昂贵,耗时较长,这些特点极大限制了埃博拉药物研发与应用。此外,与埃博拉病毒致病机制相关的宿主细胞因子研究还很不完善,缺乏系统性探索与总结。近年来,以假基因(Pseudogene)、lncRNA(Long non-coding RNA)和circRNA(circular RNA)为代表的内源竞争性RNA(Endogenous RNA,ceRNA)被发现可以特异性吸附miRNA(microRNA),进而影响miRNA对于下游基因的调控作用。研究表明,ceRNA在阿尔兹海默症、肺纤维症、乳腺癌等人类疾病中扮演十分重要的角色。然而,与埃博拉病毒增殖相关的ceRNA研究此前还未见报道。本研究旨在构建多生命周期埃博拉病毒样颗粒,实现生物安全二级(BSL-2)条件下模拟埃博拉病毒多生命周期;绘制病毒增殖相关RNA表达谱和ceRNA互作网络;探索埃博拉病毒增殖相关RNAs相互作用机制;建立基于该病毒样颗粒的快速筛选埃博拉抑制剂的研究平台,发现抑制埃博拉病毒增殖的宿主miRNAs;从而为该病毒的感染与致病机制以及溯源研究、临床诊断与治疗、疾病预防控制提供基础数据和技术支撑。本研究包含如下四部分内容:1.多生命周期埃博拉病毒样颗粒的构建与鉴定运用反向遗传学技术和真核表达系统,构建多生命周期埃博拉病毒样颗粒,实现BSL-2条件下模拟埃博拉病毒黏附、入侵、转录、复制、病毒颗粒包装、病毒出芽、连续传代等多生命周期,从而为埃博拉病毒的基础和应用研究提供有力的技术支撑。在病毒形态学、基因和蛋白质水平,细胞内病毒增值与传代能力、遗传稳定性等多方面进行验证。结果表明,该病毒样颗粒具有典型的埃博拉病毒形态结构、基因和蛋白水平特异性、一定的增殖传代能力以及良好的遗传稳定性,可用于后续实验研究。2.埃博拉增殖相关RNA表达谱和ceRNA互作网络的构建将第一部分成功构建的多生命周期埃博拉病毒样颗粒系统应用于埃博拉全转录组学研究,在病毒侵染细胞后的0 h、24 h、48 h、72 h以及96 h对细胞进行全转录组数据监控,绘制了包括mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA在内的RNA表达谱,并且通过RNA表达趋势分析、动态共表达基因分析、权重共表达基因分析、RNA靶向序列预测等生物信息学分析过程,预测ceRNA相互作用关系,进而绘制埃博拉病毒增殖相关ceRNA相互作用网络。本部分内容为该病毒的感染与致病机制研究提供基础数据和技术支撑。3埃博拉增殖相关circRNA、miRNA、mRNA相互作用机制探索以第二部分研究成功绘制的RNA表达谱和ceRNA相互作用网络为基础,继续探究埃博拉病毒增殖相关RNAs潜在互作机制。选择在共表达网络中共表达能力最强的CLDN18基因以及与之相关的miR-30b-3p和circRNA-chr19作为研究对象,通过基因表达检测、RNA靶向序列验证、基因敲除、miRNA特异性抑制等相关实验,进一步阐明关键RNAs互作机制。结果表明CLDN18与circRNA-chr19表达趋势正相关,同时CLDN18与miR-30b-3p存在直接相互作用。并且circRNA-chr19通过与miR-30b-3p互作,进而调控CLDN18的表达。本部分内容为系统性阐述病毒增殖过程中宿主细胞基因表达调控过程以及相关生命活动变化规律提供理论基础。4.抑制埃博拉病毒增殖的宿主microRNA研究依靠可模拟埃博拉病毒黏附、入侵、转录与复制、病毒包装、出芽等多生命周期的病毒样颗粒系统,建立在BSL-2实验室快速、高效、准确筛选和评价埃博拉病毒药物的研究平台,并且利用第二章已获取的转录组学数据,运用生物信息学分析方法及病毒学验证方法,筛选抑制埃博拉病毒增殖的宿主miRNAs。结果表明,miR-150-3p与GP及VP40转录本存在直接相互作用。miR-150-3p通过调控GP及VP40表达水平,进而抑制病毒增殖。本部分内容不仅发现了抑制埃博拉病毒增殖的宿主miRNAs,也为抗埃博拉病毒药物筛选与评价工作提供新思路、新方法和新平台。