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目的探讨下调SGK3表达后食管鳞癌细胞对PI3K抑制剂GDC-0941敏感性的变化及分子机制。方法一、GDC-0941对食管鳞癌细胞增殖及PI3K、SGK3蛋白表达的影响CCK-8法检测PI3K抑制剂GDC-0941对食管鳞癌细胞增殖的影响,Western blot检测GDC-0941长时间处理食管鳞癌细胞对PI3K、SGK3相关蛋白表达的影响。二、SGK3表达水平对GDC-0941抗食管鳞癌作用的影响1.SGK3-shRNA慢病毒载体感染EC9706和ECa109细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达株,并挑取单克隆,Western blot检测感染效果,将下调效率最高的细胞用于后续实验。2.CCK-8、克隆形成、划痕实验、细胞周期实验检测下调SGK3后食管鳞癌细胞对GDC-0941敏感性的变化。三、SGK3表达水平对GDC-0941抗食管鳞癌作用影响的分子机制1.GDC-0941处理筛选的食管鳞癌细胞72 h,提取细胞总蛋白,Western blot检测GSK3β和β-catenin相关蛋白的表达。2.GDC-0941处理筛选的及未转染的食管鳞癌细胞0h、3 h、24 h、72 h和120 h,Western blot检测SGK3和PI3K/Akt/p70S6K通路相关蛋白的表达。3.GDC-0941与MEK抑制剂AS703026单用或联用处理EC9706和ECa109细胞72 h,提取细胞总蛋白,Western blot检测ERK和Akt/p70S6K通路相关蛋白的表达。四、SGK3表达水平对GDC-0941抗食管鳞癌作用影响的体内评价及分子机制1.用筛选的LV3-SGK3-ECa109和LV3-NC-ECa109单克隆细胞株建立裸鼠移植瘤模型,并用GDC-0941进行治疗。绘制肿瘤生长曲线,并计算肿瘤抑制率及相对肿瘤增殖率。H&E染色法、TUNEL法检测瘤组织中细胞的形态及凋亡情况。小鼠体重变化、血常规参数、肝肾指标检测及H&E染色评价药物的毒性。2.Western blot检测瘤组织中GSK-3β和β-catenin蛋白的变化。结果一、GDC-0941抑制食管鳞癌细胞增殖但升高SGK3蛋白的表达1.GDC-0941对食管鳞癌细胞EC9706和ECa109的增殖均有抑制作用,GDC-0941 作用于 EC9706 24 h 的 IC50 值为 18.67± 1.27 μM,48 h 的 IC50 值为11.05±1.04 μM。GDC-0941 作用于 ECa109 24 h 的 IC50值为 17.96±1.25 μM,48 h 的 IC50 值为 8.07±0.91 μM。2.随着GDC-0941处理食管鳞癌细胞时间延长,PI3K蛋白活性呈现时间依赖性的降低。但SGK3和p-SGK3水平随用药时间延长升高。二、下调SGK3表达增强食管鳞癌细胞对GDC-0941敏感性1.筛选出 SGK3 下调效果最好的 LV3-SGK3-1701-EC9706 和 LV3-SGK3-1077-ECa109细胞及单克隆。2.下调SGK3后,GDC-0941对食管鳞癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力有更明显地抑制作用,且下调SGK3后,GDC-0941对食管鳞癌细胞的G1期阻滞更加明显。三、下调SGK3表达增强食管鳞癌细胞对GDC-0941敏感性的分子机制1.下调SGK3后GDC-0941对GSK3β/β-catenin通路的抑制作用单独用GDC-0941,Active-β-catenin表达升高,p-GSK3β蛋白表达水平降低。下调SGK3后可以降低Active-β-catenin和p-GSK3β蛋白表达水平并可以降低由 GDC-0941 引起的 Active-β-catenin 的升高。2.下调SGK3对PI3K下游蛋白表达的影响单独下调SGK3抑制p-p70S6K的表达,GDC-0941短时间处理下调SGK3细胞后能够抑制Akt/p70S6K信号通路,但长时间使其再激活。3.长期应用GDC-0941引起细胞中Akt/p70S6K的再激活与激活ERK有关GDC-0941能够激活ERK,使p-ERK表达升高。MEK抑制剂AS703026可以抵消由GDC-0941作用引起的p-ERK的升高,并增强GDC-0941对p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、p-p70S6K 的抑制作用。提示 GDC-0941 对Akt/p70S6K的短时间抑制和长时间再激活与ERK的代偿性激活有关。三、下调SGK3表达增强GDC-0941对食管鳞癌肿瘤生长的抑制作用1.肿瘤生长曲线和肿瘤抑制率及肿瘤相对增殖率均显示下调SGK3促进GDC-0941对食管鳞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用。H&E染色结果显示,下调SGK3和单用GDC-0941均可以引起不同程度的细胞缩小和细胞核皱缩等细胞凋亡相关的细胞形态,联用组凋亡现象更明显。TUNEL结果显示,下调SGK3和单用GDC-0941都存在明显的细胞凋亡,两者联用组的细胞凋亡率最高。各组小鼠的体重、血常规参数、脏器系数均无明显变化,肝肾毒性检测指标和肝肾H&E染色结果未见异常。2.Western blot结果与体外结果相同,单独用GDC-0941,Active-β-catenin表达升高,p-GSK3β蛋白表达水平降低。下调SGK3后可以降低Active-β-catenin和p-GSK3β蛋白表达水平。从而消除GDC-0941对Active-β-catenin的激活。结论下调SGK3水平能通过调控SGK3/GSK3β/β-catenin信号通路增强食管鳞癌细胞对GDC-0941的敏感性。