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第一部分Leber遗传性视神经病变患者筛查及资料收集
第二部分Leber遗传性视神经病变T14484C突变家系分子机制研究
目的：1.在全国各地收集视神经病变家系,建立临床资料和分子遗传学资料数据库.
2.对收集到的家系三个原发位点(G3460A、Gll778A、T14484C)进行检测是否在中国人群中存在及统计突变发病频谱.
3.对其中T14484C家系进行线粒体基因组全序列测序,分析继发位点和其它影响功能的突变位点对T14484C家系的外显率和发病严重程度的影响.
4.了解T14484C突变在中国人群中的临床表现、外显率、发病年龄、男女发病比例;分析其它因素(如核基因、环境因素、单倍型和生理心理因素等)对外显率和发病严重程度的影响.
方法：1.通过温州医学院眼视光医院与北京中医药大学东方医院眼科和福建医科大学附属第一医院合作,建立起视神经病变家系收集网络,另外还有全国各地医院和科研院所送来的少量家系资料.经温州医学院伦理道德委员会及辛辛那提儿童医院医学中心委员会许可,病人及所有受试者同意,签署知情同意书,采集血样,了解家系情况,并建好数据库.
2.对该家族中的所有成员进行眼科临床检查,包括标准对数视力表检测视力,俞自萍色觉图检查,Humphrey视野计按程序SITA检查(Humphrey Visual Field AnalyzerIIi,SITAStandard),德国罗兰电生理仪(Roland Consult RETI port gamma,pattern or flash VEP)检查视觉诱发电位(VEP)以及佳能眼底数码彩照(Canon CR6-45NM fundus camera)拍摄眼底.
3.对采集的血样提取基因组DNA,并设计包含三个原发位点的三对引物进行PCR扩增、纯化和测序.
4.对其中检测出的T14484C家系设计出扩增线粒体基因组全序列的24对引物,然后进行PCR扩增、纯化并测序.
5.使用各种生物软件分析测序结果,找出所有的多态性位点和突变位点,分析其对功能的影响.
6.对收集的临床资料进行整理,分析其与各个突变位点之间的关联性.
结果：1.我们共收集了345个视神经病变的家系,其中检测出LHON三个原发位点(G11778A、G3460、T14484C)的家系共129个,在患者中没有发现三个原发位点同时出现两个或三个突变位点的情况.其中发生T14484C突变的家系有15个,占三个原发位点发病率的11.6﹪(15/129).而其它位点(G3316A、C3394T、T3497C)家系21个,G11696A突变家系14个,G11696A和G11778A双位点突变家系3个,另外也发现了影响功能突变位点(A4435G、A15951G、A10059G)的家系各1个.
2.对其中6个T14484C突变家系研究,发现患者发病年龄从6岁到26岁不等,平均18.9岁;视力损害程度从正常到重度不等,多为中度到重度;各个家系男女发病比分别为3:0、1:0、1:0、3:0、2:0、1:1,而男女发病比为11:;各个家系外显率分别为18.8﹪、5.9﹪、16.7﹪、23.1﹪、22.2﹪、15.4﹪,平均为16.2﹪.
3.通过对以上6个Leber遗传性视神经病变T14484C突变的家系线粒体基因组全序列进行测序后分析,除了T14484C突变外,这些家系先证者线粒体DNA呈现一种独特的多态性:在D-loop区总共有36个变异位点,都已经被报道过;而在13个多肽编码区存在着更多的变异位点,共有65个,其中25个还没有被报道过,但大多数为同义突变,共有30个,而错义突变位点有25个,未曾报道过的错义突变位点有11个,分布于13个多肽编码区上;在12S rRNA基因区存在3个已报道的多态位点,在16S rRNA基因区也存在3个多态位点,其中1719InsG未见报道;另外在为22个tRNA基因编码区也存在多态性位点共2个:tRNAG5821A和tRNAT10031C.另外在家系WZ147中存在一个与LHON有关的其它突变位点(G3316A).对其它RNA基因区的变异位点和编码区因突变发生改变的氨基酸在人、牛、鼠、蟾蜍中进行比对,发现它们在进化上并不保守.
4.线粒体DNA单体型的分析发现这6个家系的mtDNA分别属于R11、D4、C、C4、C、M8a,说明他们不是来自于一个中国祖先,发病呈散发现象.
结论：1.在中国人群中存在T14484C突变,并可使携带者致病,但并不是每个携带者都发病,发病外显率为16.2﹪,与G11778A相比明显为低.在160个中国正常人群中没有发现T14484C突变的存在.
2.T14484C在中国人3个原发位点突变中的发病频谱为11.6﹪.
3.在6个T14484C突变家系中发病男性明显多于女性,男女比例为11:1,多发生在青年人身上.
4.在研究的6个T14484C突变家系中,他们的线粒体单倍型分别属于Rll、D4、C、C4、C、M8a,并没有找到这些单位型与外显率和发病严重程度之间的联系.
5.这些家系先证者和家系成员发病,多数视力都有所恢复,有的甚至不经过治疗也能恢复到正常视力,恢复率大约为75﹪,高于国外报道.
6.母系成员尽管携带有相同的mtDNA,但表现出不同的病情、发病年龄及愈后,虽然还没有定论,但目前大多数学者认为LHON的外显率和表现度与核修饰基因、环境因素及单体型有关,有待更进一步的深入研究.
第三部分Leber遗传性视神经病变G11696A突变家系分子机制研究
目的：1.对其中G11696A的家系进行线粒体基因组全序列测序,分析继发位点和其它影响功能的突变位点对G11696A家系的外显率和发病严重程度的影响.2.了解G11696A突变在中国人群中的临床表现、外显率、发病年龄、男女发病比例:分析其它因素(如核基因、环境因素、单倍型等)对外显率和发病严重程度的影响.
方法：1.对其中检测出的两个G11696A突变家系设计出扩增线粒体基因组全序列的24对引物,然后进行PCR扩增、纯化并测序.2.使用各种生物软件分析测序结果,找出所有的多态性位点和突变位点,分析其对功能的影响.3.对收集的临床资料进行整理,分析其与突变位点之间的关联.
结果：1.这两个G11696A突变家系患者发病年龄分别为10岁和17岁,平均13.5岁;视力损害程度多为轻度到中度;各个家系外显率分别为10.0﹪、9.1﹪,平均为9.5﹪.2.在先证者及家系成员未能检测到最常见的三个原发mtDNA突变位点(G3460A、G11778A、T14484C),但在两个先证者及其家系母系成员中均发现ND4.G11696A突变位点,并导致ND4亚基312位的缬氨酸变成异亮氨酸.167名中国正常对照分析发现只有一例是阳性(男,25岁).这两个家系存在许多的多态性位点:D-100p区有10个,rRNA有5个,在多肽编码区存在25个突变位点:其中14个为无义突变,11个为错义突变;WZ21-Ⅲ-3还存在3个新的变异ND2亚基T4500C(S11P),ATPase 6亚基C8702T(T59I)和ND4L亚基T10663C(V65A).通过对牛、小鼠、蟾蜍及人几个不同物种保守性分析,这些发生变异的位点和氨基酸在进化上并不保守.3.线粒体DNA单体型的分析发现这两个家系的mtDNA属于D4,没有发现有其它影响功能位点的存在.
结论：1.在中国人群中存在G11696A突变,并可使携带者发病,但并不是每个携带者都发病.在167个正常对照中发现一例G11696A突变,说明G11696A突变不是致病的唯一因素.
2.这两个G11696A家系都只有一名男性发病,发病年龄平均13.5岁,平均外显率极低,约为9.5﹪,远低于原发位点G11778A、T14484C的外显率.
3.在研究的两个家系中,他们的线粒体单倍型都属于D4,可能来自一个共同的祖先,并没有找到这个单位型D4.与外显率和发病严重程度之间的关联.
4.不完全外显率、临床表现和在正常对照出现(1/167)表明G11696A突变本身不足以导致LHON的发生,可能其它因素在这两个LHON家系的表型表达中也起一定的作用.在这些家系mtDNA中缺乏影响重要功能突变位点的存在,排除了线粒体背景及其它可能的新突变位点对LHON临床表型的影响.因此,核修饰基因、环境因素可能对两个中国Gll696A突变家系的外显率和发病严重程度起促进作用.