研究背景RET酪氨酸激酶受体在神经系统和肾脏等器官的发育过程中都发挥着重要作用。在神经系统中,RET受体主要表达于中脑、交感神经节和感觉神经节,例如在成年大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG),大约一半的神经元中表达RET受体,这类神经元也被称为非肽能感受器。RET受体在这类神经元的生长发育和维持过程中具有至关重要的作用。RET的配体为一类胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)家族配体(GDNF family ligands, GFLs)。目前已经发现的GFL家族成员包括GDNF、 neurturin (NRTN)、 artemin(ARTN)和persephin(PSPN),分别与四种膜锚定蛋白共受体GFRα1-4形成GFL/GFRα复合物进而与细胞膜表面的PET结合激活其下游信号转导。活化的RET受体通过激活下游信号通路包括RAS/MAPK和PI3K/Akt等来促进细胞的存活、迁移和突起生长等。非肽能感受器神经元中同时也表达另外一种神经营养因子受体TrkB (tropomyosin-related kinase B),该受体也已被证明在多种神经元中具有促进生长发育和维持存活的功能。近期有报道表明在非肽能感受器神经元中RET主要功能是促进神经元的突起生长,而TrkB则负责维持其存活。这提示我们两种受体在此类神经元中的某些差异可能导致他们发挥不同的功能。受体在细胞膜表面正常分布是其行使功能的关键步骤之一,已有许多报道表明可以通过调节细胞膜表面受体的含量来控制细胞对特定胞外信号的反应强度。虽然GFL诱导的RET信号通路已经研究的比较清楚,但目前关于RET受体的膜表面分布的分布调控尚无报道。越来越多的研究发现一些关键的氨基酸序列或者位点在精确调控受体向细胞膜表面转运的过程中发挥着重要作用,而且在这一过程中,也常会有一些胞内蛋白激酶参与。然而,是否存在类似机制可以调控RET的膜表面分布尚无报道。因此,我们的研究旨在探明RET受体膜表面分布是否受到调控并探究其调控的具体机理,为更为深入的阐明GFL/RET信号通路的调控机制提供理论基础。研究目的1.对比RET和TrkB受体在DRG神经元细胞膜表面的分布水平是否存在差异,并寻找决定其分布水平的关键氨基酸序列。2.寻找在RET膜表面分布调控过程中发挥作用的胞内蛋白激酶。3.检测神经元活性是否可以调控RET的膜表面分布。4.通过改变RET膜表面水平,观察是否影响配体诱导的RET信号和功能。方法与结果1.DRG神经元细胞膜表面RET与TrkB受体分布水平的比较我们首先利用免疫组织化学染色的方法确定了RET和TrkB受体在新生7天大鼠的DRG神经元中存在共表达。然后将DRG神经元进行体外培养,利用膜表面蛋白生物素化的方法收集膜表面蛋白,通过western blot检测膜表面的RET、TrkB含量,并与免疫沉淀方法得到的相应的受体表达总量对比得到受体膜表面分布的相对比率。通过此方法我们发现二者的膜表面分布水平存在显著差异,RET的膜表面水平大约为TrkB的1.5倍。2.RET与TrkB的胞内域决定了它们具有不同的膜表面含量接下来我们利用构建嵌合蛋白受体的方法在PC12细胞中检测了RET与TrkB膜表面分布水平差异的自身结构基础。我们构建了互换胞外域的嵌合受体(RETTrkBIC和TrkBRETIC)并体外转染入培养的PC12细胞。利用膜表面生物素化的方法收集膜表面蛋白,通过western blot定量分析嵌合受体的膜表面分布水平。结果发现在胞外域相同的情况下(RET和RETTrkBIC、TrkB和TrkBRETIC),不同的RET和TrkB胞内域仍然导致了不同的膜表而分布水平,证明了是胞内域结构决定了RET和TrkB的膜表而水平差异。3.受体细胞膜表面分布水平免疫荧光定量分析方法的建立为了更为直观地反映受体膜表面含量和总表达量的比率,我们引入了以前工作中采用的受体细胞膜表面分布水平免疫荧光定量分析方法。构建了N-端带有Flag标签和C-端融合了绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的嵌合受体,将这种嵌合受体转染入PC12细胞,在非透化条件下以Flag抗体做免疫荧光染色时,膜表面染色的红色荧光可代表膜表面的受体的含量,绿色GFP荧光则可代表总的受体表达量,这样便可以直观的观察到受体的的膜表面分布水平并可以利用红色／绿色荧光的比值来相对地比较各受体之间膜表面分布水平的差异。我们利用生物素化的方法证明了Flag标签和融合了GFP蛋白的引入不影响受体的膜表面分布。以此嵌合受体为基础,应用免疫荧光定量分析方法得到的结果也与生物素化方法得到的结果基本一致,所以我们在此后的研究中主要采用了免疫荧光定量分析方法来定量比较不同嵌合受体的膜表面分布水平。4.RET的近膜区的Boxl模序决定了RET在细胞膜表面具有与TrkB不同的分布水平在已知胞内域决定RET与TrkB受体不同膜表面分布水平的基础上,我们将两种受体的胞内相对应的结构域进行了相互转换,外源转染入PC12细胞,利用免疫荧光定量分析方法对比结构域互换对受体膜表面水平的影响。结果发现近膜区(Juxtamembrane region, JM)的互换导致RET膜表面含量显著下降而TrkB的含量则显著上升,证明了JM区是二者具有不同膜表面分布水平的充分必要结构域。为进一步确定具体的调控序列,我们依据RET和TrkB JM区序列的同源性比对结果把该区域细分为三个BOX域进行序列互换。发现RET Box1模序置换入TrkB可将其膜表面水平提高约1.5倍,而TrkB Box1模序置换入RET则将其膜表面水平下调至对照组的约0.6倍。这一关键结果也利用生物素化的方法得到了重复验证。将Boxl模序置换的RET和TrkB嵌合受体转染入培养的DRG神经元也得到了相似结果,证明Boxl模序区域决定了RET在细胞膜表面的分布水平高于TrkB。5.PKC活性可以促进RET的膜表面分布对RET的Box1区域预测分析发现其Thr675残基可能是一个潜在的蛋白激酶C的磷酸化位点。我们初步先利用加入抑制剂或者激动剂的方法证明了PKC可以促进RET的膜表面分布,同时将Thr675突变为Ala(T675A)使其不能被磷酸化则阻断了PKC的作用,而突变为Asp(T675D)模拟Thr的持续磷酸化可提升RET的膜表面含量。这证明了PKC对RET膜表面分布的调控作用并间接地说明了这种作用可能是通过磷酸化Thr675位点实现的。6.神经元去极化通过激活PKC增强RET受体的膜表面插入结合已有许多报道显示神经元活性通过激活胞内蛋白激酶如PKC等来调控受体的膜表面插入,我们应用高K+作用去极化结合蛋白激酶抑制剂的方法研究活性对RET膜表面分布的影响及其与蛋白激酶的联系。50mM KCl作用可以显著增强RET的膜表面分布,而这一作用可以被PKC抑制剂和T675A突变所阻断,证明去极化通过激活PKC可以增强RET的膜表面插入。7.Thr675位点磷酸化介导了PKC和去极化对RET膜表面分布的调控为证明PKC和去极化对RET膜表面分布的调控通过磷酸化Thr675位点实现,我们制作了特异性识别磷酸化Thr675位点的抗体。在PKC激动剂和去极化作用下,Thr675的磷酸化水平显著升高。相对于胞内的RET,膜表面的RET具有更为显著的磷酸化倾向。这部分结果证明了Thr675位点磷酸化介导了PKC和去极化对RET膜表面分布的调控。8.Thr675位点可调控RET对GDNF刺激的反应强度受体膜表面分布水平的调控可以改变细胞对外界刺激的反应性。在已知Thr675影响RET膜表面分布水平的条件下,我们观察了突变Thr675位点对RET介导的信号转导及功能的影响。在外源转染的PC12细胞中,T675A突变降低了GDNF刺激时RET受体的激活水平,下游信号分子Erk1/2和Akt磷酸化水平也显著降低,通过RET诱导的PC12细胞分化率也明显降低。结论1.两种神经营养因子受体RET和TrkB具有不同的膜表面分布水平,并证明Box1模序决定了二者的差异。2.神经元去极化通过激活蛋白激酶C进而磷酸化RET Thr675位点,实现对RET膜表面分布的促进作用。3.RET Thr675位点影响RET介导的信号转导和生物学功能,这一作用可能通过调控RET的膜表面分布水平来完成。