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氟中毒是一种地方性疾病,严重影响我国部分地区居民身心健康。其中氟骨症是主要临床和病理改变。氟中毒虽然病因清楚但发病机制迄今尚不明确。我们过去的研究发现成骨细胞(OB)功能活跃和骨转换加快是氟骨症的重要特征和多类骨科疾病的病理基础,而OB钙稳态的变化则是OB成骨功能增强的重要启动环节。钙敏感受体在调节维持体内Ca2+稳态过程中有决定性意义。同时,MAPK信号通路中P38、JNK以及ERK信号通路均在骨相分化方面起重要作用。既往研究发现氟化物可明显刺激Ca SR和OB特异性转录因子RUNX2的表达,并认为氟刺激OB功能增强是氟骨症发病的重要机制之一,但对其中间具体途径以及之间的关联尚不清楚。因此,本文将从CASR/MAPK信号通路入手,讨论氟是否通过刺激Ca SR/MAPK信号通路,增强OB中RUNX2表达,进而促进OB成骨功能增强,试图发现Ca SR/MAPK信号通路在氟骨症发生机制中的重要作用,为日后的研究提供重要的研究背景与理论依据。实验方法:本实验采用体外实验方法。研究对象为MC3T3-E1 Subcone 14小鼠前成骨细胞细胞株。实验分为四组:对照组,低氟组,中氟组,高氟组。含氟量分别为0mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L。染氟时间为48小时。具体方法包括:实时定量PCR和Western-Blot方法检测细胞Ca SR、PKC、KRAS、JNK、P38MAPK、ERK、RUNX2等m RNA、蛋白表达水平,并对所检测的各种因子与Ca SR及RUNX2进行相关性分析;钙钴法检OB碱性磷酸酶活性。实验结果:1.染氟OB中CASR信号通路相关因子的变化(1)Ca SR m RNA水平在高氟组明显上调,蛋白水平则在3个实验组均明显升高;(2)PLC m RNA表达在3个染氟组均明显增强;(3)Gq/11/14的蛋白表达在各染氟组均呈上升趋势,并在中、高氟组明显升高;Gna11 m RNA在中、高氟组升高明显,而Gna14 m RNA则在低、高氟组升高明显;(4)PKC三个因子Prkca、Prkcb和Prkcag的m RNA表达除Prkca低氟组外,均为明显增强;PKC蛋白的表达量亦与氟浓度同步升高;(5)KRAS m RNA在低、中氟组有增高表现,但其蛋白在各氟组均表达下降。2.染氟OB中MAPK信号通路的变化(1)染氟OB P38MAPK m RNA和蛋白表达均呈明显增高趋势,差异显著;(2)OB ERK蛋白在中、高氟组表达明显增强,m RNA表达在三个染氟组均有所下调;(3)染氟刺激JNK m RNA和蛋白表达量明显上升,有统计学意义。3.染氟OB RUNX2变化(1)各染氟组RUNX2 m RNA表达持续升高,在中、高氟组效果明显;(2)中、高氟组RUNX2蛋白水平明显升高。4.CaSR与CT m RNA在低染氟组时正相关,高氟组却为负相关。5.染氟OB中骨生长因子,均发生了不同程度的过表达。6.RUNX2与Ca SR m RNA在低氟组呈现正相关。结论:1.氟化物明显影响了OB Ca SR信号通路(1)氟能明显刺激OB Ca SR、PKC蛋白及m RNA的表达;(2)染氟明显影响OB Gq/11/14 m RNA和蛋白的表达,除Gq m RNA表达呈下降趋势外,总的作用以明显上调为主;(3)染氟明显刺激OB中PLC m RNA的表达;(4)染氟后KRAS在m RNA水平明显上升,蛋白水平下降。2.氟化物明显影响了OB MAPK信号通路(1)氟能明显刺激JNK与P38MAPK的蛋白表达;(2)氟在高浓度时能刺激ERK蛋白的产生。3.CASR/MAPK信号通路因子与RUNX2在m RNA和蛋白水平上具有一定相关性。本文所取得的实验结果,基本印证了我们的实验预期:氟骨症中成骨细胞功能增强是氟骨症发生发展的始动环节,而CASR/MAPK信号通路因子与RUNX2之间的关联和影响在成骨功能增强方面具有重要作用。虽然还有一些不清晰的地方,但本实验结果提示在探讨氟骨症发病机制的工作中CASR/MAPK信号通路应该得到重视和更深入的研究。