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铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，它可以感染许多免疫缺陷病人，例如患有肺部囊性纤维化、艾滋病、烧伤和癌症等病人。铜绿假单胞菌有急性和慢性感染两种类型。在急性感染中，它能够分泌多种毒力蛋白，其中三型分泌系统(T3SS)分泌的毒力因子在急性感染中，能够导致宿主细胞的快速死亡。生物被膜是慢性感染中在宿主体内形成的菌群聚集体，赋予铜绿假单胞菌多种抗生素抗性并避免了宿主免疫反应，在临床上具有反复性，难治疗。 我们实验室在前期研究中发现，当敲除野生型菌株PAK的T3SS的毒力因子和popN基因PAK△STYN，它仍然具有毒性，进一步通过比较PAK△STYN与PAK野生型菌株分泌蛋白的不同，发现一个命名为NDK的蛋白在这一过程中可能有一定作用。为了进一步验证NDK是否有毒性，本研究在PAK△7菌株（敲除T3SS的毒力因子、QS系统的调控蛋白和T2SS的毒力蛋白）基础上敲除了NDK基因形成PAK△8菌株。通过细菌侵染实验发现，与PAK△7菌株相比较，PAK△8菌株毒性明显降低，回补NDK基因后，毒性明显升高。通过定点突变NDK的酶活性位点，证明NDK的毒性与其酶活性位点无关。 早期研究发现NDK通过一型分泌系统(T1SS)分泌到细胞外，但是仅有粘液型菌株能够分泌NDK，我们将NDK-FLAG融合蛋白克隆到pUCP20载体上转入到PAO1、PA103和PAK中，这些菌株都能够分泌NDK。尽管T3SS针状复合物缺失的菌株PAK△pscF分泌NDK并不受T3SS针状复合物缺失的影响，但是其分泌的NDK进入HeLa细胞的量与PAK△STY菌株相比较明显减少。这说明NDK的分泌没有菌株特异性，但分泌到胞外的NDK在进入真核细胞内的过程中需要T3SS针状复合物的参与。 通过免疫荧光实验发现分泌到细胞外的NDK能够粘附在细菌外膜上。由于NDK在进入真核细胞内的过程中需要T3SS针状复合物的参与，因此利用细菌双杂交实验筛选与NDK相互作用的T3SS针状复合物结构蛋白，发现转运装置上的PopD蛋白能够与NDK相互作用，通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验进一步证明PopD和NDK能够相互作用。将全长的NDK、N端的NDK和C端的NDK分别与mApple荧光蛋白融合，其中，全长的NDK和C端的NDK融合蛋白能够正常分泌，而N端的NDK融合蛋白不能够分泌，这也与NDK通过T1SS分泌的结论相一致。通过免疫共沉淀发现C端NDK结构域是与PopD结合的主要结构域。用这些不同融合蛋白的菌株侵染HeLa细胞，发现全长的NDK和C端的NDK融合蛋白能够使HeLa发红光，而N端的NDK融合蛋白却不能，T3SS针状复合物缺失的菌株特别是PopD蛋白缺失的菌株PAK△popD，不能将自身表达和分泌的全长NDK-mApple融合蛋白侵入到HeLa细胞中，这也在体内实验中证明了NDK侵入到HeLa细胞中需要T3SS针状复合物中PopD蛋白。 本研究的内容和结论小结如下，一是确定了NDK对真核细胞的毒性作用，并证明其毒性与其酶活性无关，并发现多种野生型菌株而并非只有粘液型菌株可以分泌NDK，这些研究对NDK的功能和铜绿假单胞菌的毒性有了进一步了解;二是发现了经过T1SS分泌到细菌外的NDK可以粘附在细菌外膜的T3SS转异装置PopD蛋白上，并通过T3SS的针状复合物进入到HeLa细胞内，而这个过程中，NDK的C端结构域起主要作用;三是在体内试验中验证了NDK携带较大蛋白mApple侵入HeLa细胞需要NDK的C端序列和T3SS的针状复合物，这对于携带其他蛋白进入细胞发挥功能，具有一定的应用价值。