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研究背景和目的：肝纤维化是肝损伤后的修复反应,主要特征为肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积。早期肝纤维化是可以逆转的,因此对肝纤维化早期始动机制的研究具有重要意义。活化蛋白-1(active protein-1,AP-1)是一种与组织纤维化密切相关的转录调控因子,它可以在转录水平调节胶原基因的表达：还可以调控转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta,TGF-β1).组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor metal proteinase,TIMP-1)等促纤维化细胞因子的表达。可见AP-1是一种与ECM合成、降解密切相关的转录因子。然而目前对AP-1在肝脏纤维化中的表达研究尚少,对于AP-1在肝脏纤维化进程中介导细胞外基质表达的分子机制亦不十分清楚。血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)是已知最强的HSCs有丝分裂剂。PDGF通过与其受体(PDGF receptors,PDGFR)结合启动下游蛋白的级联磷酸化反应来发挥生物学效应。近年来对PDGF/PDGFR的信号转导途径有许多新的发现。有研究表明,在人肾小球系膜细胞,PDGF-BB可以通过MAPK/AP-1信号途径来诱导靶基因表达；在SD大鼠的血管平滑肌细胞,PDGF-BB可以诱导AP-1的DNA结合活性。但目前对PDGF-BB信号通路在肝纤维化体内实验中与MAPK/AP-1信号通路的关系尚无明确报道。本研究采用CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,观察：1)中药肝复康对肝纤维化大鼠肝功能和肝组织形态学的影响；2)肝复康对AP-1在肝纤维化大鼠肝组织中表达的影响;3)PDGF-BB/PDGFRp和MAPK/AP-1信号通路在大鼠肝纤维化模型中的关系及肝复康对二者表达的影响。方法：SD大鼠,随机分为正常对照组、12周模型组(12w)、20周模型组(20w)、肝复康高、中、低剂量治疗组和预防组。除正常对照组,其余组大鼠皮下注射以橄榄油稀释的10%的CCl4(0.5 mg·kg-1),每周2次,共12周；正常对照组注射同体积CCl4溶媒。肝复康预防组从CCl4注射第1周开始,给予肝复康(312.5 mg·kg-1·d-1,po)；第12周末,将12w模型组和肝复康预防组处死。肝复康高、中、低剂量组从CCl4注射第9周开始,分别给予肝复康高、中、低剂量(3125、312.5和31.25mg·kg-1·d-1,po)；第20周末,将20w模型组和肝复康高、中、低剂量治疗组处死。采集大鼠血及肝组织。赖氏法测血清ALT和AST活性；溴甲酚绿比色法测白蛋白；考马斯亮蓝比色法测球蛋白。HE染色观察肝组织形态结构变化。双盲法采用Ishak评分系统对肝脏纤维化程度进行组织学评估。免疫组织化学法观察c-Fos.c-Jun.PDGF-BB.PDGFRβ和α-SMA蛋白在肝组织的表达；逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定c-fos.c-jun.PDGF-BB. PDGFRβ.TIMP-1和α1(Ⅰ)型前胶原基因的表达水平；电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)测定AP-1的DNA结合活性；免疫蛋白印记(Western blot)检测p-ERK1/2.p-JNK1/2. p-p38MAPK.α-SMA和Ⅰ型胶原在肝组织的表达；实验结果以均数±标准差((?)±s)表示,采用SPSS统计软件。组间比较采用方差齐性检验,作单因素方差分析。p<0.05表示差异有显著性。本研究结果如下：1.肝复康对肝纤维化大鼠肝功能和肝组织形态学的影响HE染色肝组织病理切片结果显示,与正常组相比,12w和20w肝纤维化模型组肝组织结构破坏：假小叶形成、纤维间隔不规则增厚、肝细胞脂肪变性和大量炎症细胞浸润；肝复康预防组,炎症细胞浸润、肝细胞脂肪变性和纤维化得到显著改善；肝复康高、中、低剂量治疗组的肝纤维化均有不同程度改善,中剂量组(312.5mg/kg/d)效果最明显。与正常组相比,12w和20w肝纤维化模型组的血清ALT和AST活性均显著上调,而白蛋白/球蛋白比(A/G)均下降；其中12w模型组ALT和AST活性上调最为明显(p<0.01)。与12w模型组相比,肝复康预防组血清ALT和AST活性显著下调,A/G上调；与20w模型组相比,肝复康中剂量和高剂量治疗组(312.5和3125mg/kg/day)下调ALT和AST活性、上调白/球蛋白比效果明显。2.肝复康对AP-1在肝纤维化大鼠肝组织中表达的影响免疫组化结果显示,正常组几乎不表达c-Fos和c-Jun;12w模型组肝组织可见大量c-Fos和c-Jun核阳性表达；与12w模型组相比,肝复康预防组阳性表达显著减少,仅余少量胞浆表达。20w模型组亦可见显著核阳性表达；与20w模型组相比,肝复康治疗组阳性核表达显著减少,其中中剂量组效果最明显。RT-PCR结果显示,c-fos和c-jun mRNA在正常对照组无表达,12w和20w肝纤维化模型组c-fos和c-jun mRNA水平显著增加(p<0.01)；与12w模型组相比,肝复康预防组二者表达下调。与20w模型组相比,肝复康治疗组二者表达均下降,其中中剂量组效果最明显,与正常对照组相比差异无显著性。EMSA结果显示,与正常组相比,CCl4的刺激使12w模型组AP-1的DNA结合活性显著上调；与12w模型组相比,肝复康预防组AP-1活性显著下降(p<0.01)。20w模型组AP-1的DNA结合活性亦显著升高,肝复康中剂量治疗组AP-1的DNA结合活性显著下调。3.PDGF-BB/PDGFRβ和MAPK/AP-1信号通路在肝纤维化大鼠模型中的关系及肝复康对二者表达的影响免疫组织化学结果显示,正常组大鼠肝组织几乎不表达PDGF-BB和PDGFRβ；20w模型组大鼠肝组织可见大量PDGF-BB和PDGFRβ胞浆阳性表达,肝复康治疗组二者阳性表达均显著减少,中剂量组效果最明显,仅余少量胞浆表达。Western blot结果显示,肝复康预防组亦可以显著缓解上调的PDGF-BB和PDGFRβ的蛋白表达。RT-PCR显示PDGF-BB和PDGFRβ的变化趋势与免疫组化和Western blot检测结果一致。Western blot结果显示,12w和20w的模型组大鼠肝组织的p-ERK1/2. p-JNK1/2和p-p38MAPK显著上调；肝复康预防组和治疗组的p-ERK1/2. p-JNK1/2和p-p38MAPK表达均下调(Fig.2)。Western blot和RT-PCR结果显示,与正常组相比,TIMP-1和Ⅰ型胶原在12w和20w肝纤维化模型组的表达均显著上调；而肝复康预防组和治疗组二者表达明显减弱。PDGF-BB/PDGFRβ和三条MAPKs信号通路的表达趋势与TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达趋势一致。统计学相关性分析显示,各组TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达与PDGF-BB/PDGFRβ和MAPKs/AP-1信号通路的表达呈显著正相关。结论：1.肝复康中剂量治疗组显著改善肝功能、减轻肝损伤：肝复康预防组肝纤维化程度亦明显减轻,提示肝复康对肝损伤具有预防和缓解作用。2. AP-1参与了大鼠肝纤维化的发生发展,肝复康可以显著抑制AP-1的活性。3.肝复康可能通过抑制PDGF-BB/PDGFRβ和MAPKs/AP-1两条信号通路来影响肝纤维化中TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达。