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胚胎损失是母猪繁殖面临的重大问题之一。早期胚胎损失数占胚胎损失总数的60%以上,是胚胎损失的敏感时期。研究报道,精氨酸在哺乳动物早期胚胎发育时期发挥重要作用,可减少胚胎损失。哺乳动物早期胚胎发育是由一系列高度保守、可调控、可预测的细胞分裂等事件构成的,主要包括:精卵结合形成受精卵、最初的胚胎细胞分裂（卵裂）、合子基因组激活（zygotic genome activation,ZGA）,桑椹胚的致密化和形成具有植入能力的囊胚。因此,本研究旨在探究精氨酸在猪早期胚胎发育时期的作用机制。试验共分为四部分:1.猪体内早期胚胎单细胞转录组测序分析首先,试验母猪发情后进行自然交配,在发情后3-7天对配种母猪进行手术冲胚,共收集体内发育的合子、2-细胞、4-细胞、8-细胞和桑椹胚五个发育阶段的胚胎。随后,将各发育阶段的胚胎分离成单卵裂球,进行单细胞转录组测序。结果显示,在猪体内4-细胞到2-细胞发育阶段中差异基因数目最多,说明猪的主要ZGA发生在4-细胞阶段。KEGG富集结果显示,4-细胞期和2-细胞期差异基因主要富集在RNA转运、核糖体生物合成、内质网中的蛋白质加工、精氨酸和脯氨酸代谢等信号通路。结果表明,精氨酸代谢可能在ZGA时期发挥重要作用。随后,通过精氨酸代谢通路聚类热图分析结果显示,在猪早期胚胎发育过程中,与精氨酸代谢相关的基因在4-细胞阶段开始表达。此外,相关性分析结果显示,精氨酸代谢基因与ZGA基因存在相关性。2.精氨酸对猪合子基因组激活的影响为验证精氨酸是否影响ZGA,将猪体外受精（In vitro fertilization,IVF）胚胎在正常PZM-3培养基（对照组）、改良的PZM-3培养基（阻滞组,缺乏精氨酸及其他氨基酸、丙酮酸和牛磺酸,0 m M精氨酸）和添加精氨酸的改良PZM-3培养基（精氨酸组,0.12 m M精氨酸）中培养。观察三组胚胎发育情况并统计培养72 h后4-细胞胚胎发育阻滞率,并检测猪ZGA标志基因（EIF1A、DPPA2和ZSCAN4基因）和转录早期产物SIRT1蛋白在4-细胞胚胎中的表达。结果显示,与对照组相比,阻滞组的4-细胞发育阻滞率显著提高（P＜0.05）。与对照组相比,阻滞组的胚胎培养72 h后4-细胞阻滞率显著升高（P＜0.05）。添加0.12 m M精氨酸可使胚胎越过4-细胞阻滞继续发育,精氨酸组的4-细胞发育阻滞率显著低于阻滞组（P＜0.05）。先前的测序结果证实,猪的主要ZGA是在4-细胞阶段。这正是胚胎在改良的PZM-3培养基中发育停滞的阶段。同时,与对照组相比,阻滞组的4-细胞中猪的ZGA标志基因（EIF1A、DPPA2和ZSCAN4）和早期转录产物SIRT1蛋白表达量均显著降低（P＜0.05）。精氨酸组的4-细胞胚胎中猪（EIF1A、DPPA2和ZSCAN4）和早期转录产物SIRT1蛋白表达量与阻滞组的相比显著升高（P＜0.05）。3.精氨酸对猪合子基因组激活时期胚胎代谢的影响体外培养48 h后,分别收集对照组、阻滞组和精氨酸组4-细胞胚胎。利用荧光探针对每组的4-细胞胚胎进行染色,分别检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）和ATP水平、线粒体膜电位变化和脂滴含量,评估精氨酸对猪ZGA时期胚胎代谢状态的影响。使用荧光显微镜捕获4-细胞胚胎的图像,分析胚胎的荧光强度。结果显示,与对照组相比,阻滞组4-细胞胚胎中ROS水平显著升高（P＜0.05）,但GSH水平显著降低（P＜0.05）。精氨酸组与阻滞组相比4-细胞胚胎内ROS含量水平显著降低（P＜0.05）,GSH水平显著升高（P＜0.05）。与对照组相比,阻滞组4-细胞胚胎中ATP水平显著降低（P＜0.05）。精氨酸组与阻滞组相比4-细胞胚胎的ATP水平显著提高（P＜0.05）。与对照组相比,阻滞组4-细胞胚胎中脂滴含量显著降低（P＜0.05）。精氨酸组与阻滞组相比4-细胞胚胎的脂滴含量显著提高（P＜0.05）。然而,对照组、阻滞组和精氨酸组的线粒体膜电位变化差异不显著（P＞0.05）。4.精氨酸影响猪合子基因组激活的代谢途径在体外培养48 h后,分别收集对照组、阻滞组和精氨酸组的4-细胞胚胎,检测胚胎的NO含量、NOS和ODC1基因表达,并收集各组的胚胎培养基,测定其多胺（胍丁胺、S-腺苷-L-蛋氨酸、腐胺、尸胺、亚精胺和精胺）含量。结果显示,与阻滞组相比,精氨酸组4-细胞胚胎NO含量有增加趋势,但三组间差异不显著（P＞0.05）。阻滞组和精氨酸组胚胎的NOS基因表达量较对照组显著降低（P＜0.05）,但阻滞组和精氨酸组之间的差异不显著（P＞0.05）。检测三组的胚胎培养基中多胺的含量,结果发现只能检测到精胺,未检测到其他多胺。阻滞组培养基中精胺含量较对照组显著降低（P＜0.05）。与阻滞组相比,精氨酸组培养基的精胺含量显著增加（P＜0.05）。此外,阻滞组和精氨酸组ODC1的m RNA表达量与对照组比较显著降低（P＜0.05）,精氨酸组比阻滞组显著升高（P＜0.05）。上述结果表明精氨酸可能通过多胺途径影响ZGA。为了检验我们的假设,合子在补充ODC1酶抑制剂（DFMO）和精氨酸的改良PZM-3培养基中培养。在体外培养48 h后,收集4-细胞胚胎检测ODC1基因表达,并收集培养基测定其多胺含量。同时,观察胚胎发育情况并统计培养72 h后4-细胞胚胎发育阻滞率,检测猪ZGA标志基因（EIF1A、DPPA2和ZSCAN4基因）和转录早期产物SIRT1蛋白在4-细胞胚胎中的表达。结果显示,DFMO组的培养基中精胺含量和胚胎ODC1（图5E）的m RNA表达与精氨酸组相比显著降低（P＜0.05）。DFMO组4细胞胚胎的SIRT1蛋白和ZGA基因的表达水平与精氨酸组相比显著降低（P＜0.05）。此外,与精氨酸组相比,DFMO组的ROS水平显著增加（P＜0.05）,而GSH和ATP水平以及脂滴含量显著降低。综上所述,单细胞转录组测序揭示猪体内胚胎的主要ZGA发生在4-细胞阶段,精氨酸代谢与猪的ZGA存在相关性。精氨酸在营养缺乏条件下可以促进猪胚胎ZGA。精氨酸在营养缺乏条件下可以减少胚胎的氧化应激及提高胚胎的能量水平。精氨酸在营养缺乏条件下可能通过促进多胺生成调节猪的ZGA。