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丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)共生是一种广泛存在于陆生植物中的一种共生方式,并且能够与80%以上的陆生植物形成共生关系,对植物N、P、Fe、Cu等元素的吸收均具有促进作用,尤其是在P元素吸收方面更为突出,化石分析表明这种共生关系在4.6亿年前就曾存在。当植物与菌根真菌形成共生后,植物便获得了一种新的P吸收途径即菌根真菌途径又称间接吸收途径,通过该途径,植物不仅提高了P吸收效率,同时也扩大了植物在土壤中P吸收的范围。并且研究证实,菌根吸收途径在菌根植物所有P吸收途径中起关键作用(Smith etal.,2003,2004)。虽然这种共生关系的作用已被广为接受,然而对这种互利共生关系的分子机制并不清楚,本课题致力于研究与菌根有关的磷转运基因的表达调控分析。在实验室已分离的六种P转运基因的基础上,通过表达模式分析,最终分离到两种菌根特异的P转运基因即AsPT1和AsPT4,根据系统进化树分析结果表明,二者均属于Ph1磷转运家族;RT-PCR和RT-qPCR分析证实AsPT1和AsPT4基因均为菌根特异型P转运基因,即只有当植物与菌根真菌共生后才能表达。利用生物信息学方法对AsPT1和AsPT4基因的启动子区域进行已知的motif查找定位,以及通过FootPrinter2.0对二者启动子区域进行motif预测分析。
本研究通过PCR的方法对启动子进行逐步截断,以及over-lap PCR的方法对motif进行特异敲除,构建以GUS为报告基因的pBI121穿梭载体,利用发根农杆菌K599介导的方法,进行植物转化,转化植株与Glomus intraradices进行共培养一个月,通过TB染色,GUS染色以及GUS酶活检测最终得出结果如下:⑴MYCS作为已知的菌根特异的磷转运基因的顺式作用元件,在豆科植物紫云英菌根特异的磷转运基因AsPT1和AsPT4的调控中也具有重要的调控作用。⑵AsPT1基因的调控表达较为复杂,存在于其上的TGTT-motif、AAAA-motif、 TAAT-motif以及MYCS等元件具有协调调节作用,存在正负两种调控方式。TGTT-motif对AsPT1P的驱动活力具有显著调节作用。⑶AsPT4基因的调控表达较为简单,存在其上的TAAT-motif及TAAC-motif对AsPT4P驱动活力具有正向调控作用,可能作为一种增强子元件来发挥作用。综上所述,TGTT-motif、 AAAA-motif、 TAAT-motif及TAAC-motif对豆科植物紫云英中菌根特异的磷转运基因AsPT1和AsPT4具有较为明显的调控作用,而通过直系同源的菌根特异的磷转运基因的启动子序列分析表明,这些元件广泛存在于菌根特异的磷转运基因启动子中,他们可能与MYCS元件类似,具有广泛的调节作用。