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目的:探讨雌激素是否通过GPR30激活AMPK/mTOR信号通路诱导Ishikawa细胞自噬。方法:培养细胞选取分瓶传代后,对数生长期的细胞。用0、25、50、100、200ng/ml雌激素处理Ishikawa细胞24h或100ng/ml雌激素处理Ishikawa细胞0、1.5、3、6及12h,MTT法检测细胞活力的变化。Western blot法检测各组细胞中p62、LC3、beclin-1、AMPK、p-AMPK、mTOR及p-mTOR表达变化。转入经GPR30si RNA和AMPK通路抑制剂compoud C预处理的细胞。荧光显微镜观察Ishikawa细胞中自噬标记蛋白LC3表达的变化。用透视电镜观察雌激素诱导Ishikawa细胞自噬体的形成。结果:1、雌激素呈浓度及时间依赖性诱导Ishikawa细胞的自噬及增殖不同浓度的E2(0,25,50,100,200 ng/ml)作用Ishikawa细胞0,1.5,3,6,12 h,MTT测OD值,计算增殖率。实验结果显示雌激素呈时间及浓度依赖性促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖。2、GPR30参与雌激素诱导细胞自噬和增殖检测si RNA转染后对GPR30的抑制效果,我们在雌激素处理细胞前预先转染GPR30 si RNA,观察细胞自噬的变化。结果显示,LC3的表达与雌激素处理组相比,明显受到抑制,LCI/LC3II水平相对明显下降;p62表达在GPR30抑制后明显升高;而beclin-1表达,在GPR30抑制后也明显下降(P<0.05)。此外,我们还检测了AMPK信号通路的变化,结果显示,雌激素诱导AMPK磷酸化和抑制mTOR磷酸化,雌激素可以激活AMPK信号通路,GPR30si RNA预处理可以明显的抑制AMPK的激活。由此可见,雌激素通过GPR30诱导Ishikawa细胞自噬并促进其增殖,AMPK-mTOR通路明显参与这一过程。3、AMPK/mTOR参与雌激素诱导细胞自噬在上一步的研究中提到,雌激素可以激活AMPK通路,而AMPK的激活可被GPR30 si RNA所抑制,为了进一步证明AMPK信号通路参与雌激素诱导细胞的自噬。我们用AMPK抑制剂comp C预处理细胞2h后,加入100ng/ml的雌激素,用western blot法、透射电子显微镜观察自噬标记蛋白的表达及自噬体的变化,结果显示,comp C的加入可以明显抑制LC3及beclin-1的表达,并且减少细胞中自噬体的数量。此外,我们还检测mTOR表达的变化,结果所示,与雌激素组相比,estrogen+comp C组细胞的mTOR的活性明显升高,综合上文结果表明雌激素确实通过激活AMPK通路以抑制mTOR的活性而促进细胞的自噬。4、GPR30抑制阻滞雌激素诱导AMPK/mTOR信号通路的激活为了进一步明确GPR30是否介导雌激素所诱导的AMPK/mTOR通路的激活,细胞转染GPR30si RNA,及沉默GPR30的表达,观察雌激素所诱导的AMPK/mTOR通路的影响。结果显示,雌激素激活的AMPK会被明显的抑制,而AMPK下游的mTOR则由于AMPK的抑制,活性复苏。5、抑制自噬对细胞活力的影响在以上研究的基础上,为进一步的探讨自噬与细胞增殖在雌激素诱导下的关系,我们在100ng/ml雌激素处理前,用25μM自噬抑制剂3-MA预处理细胞,MTT法检测细胞活力,研究结果显示,雌激素可以增强细胞的活力,而3-MA抑制自噬后导致雌激素对增强细胞活力的作用明显降低。表明雌激素可以诱导自噬并增强细胞的活力。结论:雌激素呈浓度、时间依赖性诱导Ishikawa细胞的自噬及增殖;沉默GPR30的表达能抑制雌激素诱导Ishikawa细胞自噬及AMPK/mTOR通路的激活;抑制自噬能降低雌激素的增强细胞活力作用。因此,雌激素可以通过GPR30激活AMPK/mTOR信号通路诱导Ishikawa细胞自噬同时增强细胞活力。