高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,HAPE)是指人类快速进入高原(指海拔在2500 m以上),机体由于缺氧引起一系列生理和病理变化所致的高原特发性疾病。HAPE的发病率高,临床症状重,严重者可危及生命。目前认为HAPE的发生发展是多因素、多基因参与的复杂病理生理过程,并且受环境和遗传的双重因素的影响,同时,有明显的个体及民族差异性。研究HAPE的发病机制,寻求快速有效治疗和预防HAPE的措施是防治急性高原病的迫切需要。目前,HAPE的发病机制仍不完全明确,现有文献认为人体在低压低氧环境下,各种诱因引起肺动脉压力骤然升高,肺毛细血管通透性增加,血管收缩不平衡,收缩较弱的区域灌注增强,造成区域水肿,液体通过靠近阻力血管的动脉壁漏出、转移和潴留,引起肺间质和肺泡疾病;其中非细菌性炎性机制在HAPE发病机制中起不容忽视的作用;另外,基因改变在HAPE的发病机制中扮演重要角色,主要表现在低氧环境下与个体易感性密切相关,这些基因可能会作为一种重要的分子标志物预防和诊断疾病、评估病情严重程度,并提供有效的治疗办法。对于HAPE相关基因的研究最初主要集中在表型水平,之后也有相关基因通路的研究。现有文献报道调节血管通透性和调节血管舒缩功能、血管内稳态等多基因通路参与了HAPE的发生和发展,说明HAPE的发生是多基因调控的疾患。然而,对于这些基因在不同文献中的重复性并不一致,许多基因仍然有待于进一步的验证。而且,对于这些基因之间是如何相互作用从而导致病理生理发生改变的具体机制并不清楚,更重要的是目前对低氧信号通路上相关基因在HAPE中表达研究仍为空白。低氧信号通路包括84个与低氧信号有关的基因,这些基因直接与缺氧反应有关,还调节血红蛋白水平和氧化还原酶类活性等。低氧有关基因主要参与缺氧引起的各种病理生理过程如细胞凋亡、细胞信号转导、蛋白代谢、细胞生长、代谢、细胞外基质、黏附分子、心脏兴奋-收缩偶联等。本研究以急进青海省玉树州玉树市结古镇(海拔3780m)的HAPE患者为研究对象,急进同地区健康建筑工人为对照组,观察HAPE组和对照组的外周血白细胞、平均肺动脉压力,采用实时定量PCR(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)分析低氧信号通路上相关基因m RNA表达,筛选出HAPE急性期高表达并相关的基因鸟氨酸脱羧酶1(ornithine decarboxylase 1,ODC1)和金属基质蛋白酶9(metal matrix protease 9,MMP9);继以中等海拔组作为对照,模拟高海拔暴露SD大鼠后(模拟6000m),不同时间下观察大鼠全血白细胞及肺动脉压力变化,并检测肺组织中ODC1和MMP9基因变化情况,揭示急性缺氧对大鼠机体以及急性缺氧对ODC1和MMP9基因的影响,并探讨发生该变化的具体机制及其重要意义,进一步从基因水平验证HAPE的发病机制。第一部分高原肺水肿低氧信号通路相关基因m RNA表达目的:采用RT-PCR法分析HAPE患者外周血低氧信号通路相关基因m RNA表达,筛选出HAPE急性期高表达基因,并与恢复期比较,观察治疗前后这些基因的变化。方法:根据HAPE的诊断标准,入选急进3780m高原的建筑工人为研究对象,2012年收集12例HAPE(HAPE组)患者和9例健康对照(non-HAPE组)、2013年收集12例HAPE患者,包括急性期HAPE(HAPE-A组)和恢复期HAPE(HAPE-R组)的相关资料;通过听诊测定心率(heart rate,HR)、使用指脉氧分析仪测定动脉血氧饱和度(oxygen saturation,Sa O2)、心脏多普勒超声仪测定平均肺动脉压力(mean pulmonary artery pressure,m PAP)和血细胞分析仪测定外周血白细胞总数(white blood cells,WBC);提取外周血白细胞中总RNA,使用荧光RT-PCR法分析HAPE患者急性期与恢复期低氧信号通路基因的m RNA表达量。结果:1.HAPE组与对照组比较,HR、m PAP、WBC总数明显增高,而Sa O2明显下降(P<0.05);经过治疗后恢复期HR、m PAP、WBC数明显下降,而Sa O2明显升高,逐渐恢复正常。2.2012年HAPE组一共有23个基因高表达,其中最高表达的为SERPINE1,MMP9和ODC1次之。2013年HAPE-A组共有47个基因高表达,其中BNIP3L表达最高,其它依次为EGR1、PGF、MMP9、ODC1等,经过治疗恢复期,这些基因表达量明显下降。3.ODC1和MMP9基因芯片重复性高,并ODC1基因倍数与m PAP呈正相关,MMP9基因倍数与WBC总数呈负相关。结论:1.HAPE组急性期HR、m PAP、WBC总数明显增高,而Sa O2明显下降。经过治疗HAPE组恢复期,以上生理指标明显恢复。2.HAPE组急性期有SERPINE1、BNIP3L、EGR1、PGF、MMP9和ODC1等多个低氧相关基因高表达,恢复期以上基因表达明显下降。其中ODC1和MMP9两次芯片中重复性高,并ODC1和MMP9与肺动脉压力和白细胞水平有相关性,可能参与HAPE的发病机制。第二部分急性低氧对大鼠ODC1和MMP9的影响目的:以中等海拔(2260m)作为对照,将SD大鼠暴露于高海拔(模拟6000m)后,不同时间点检测大鼠平均肺动脉压、白细胞以及肺组织ODC1和MMP9的变化,旨在观察急性低氧暴露对ODC1和MMP9等基因的影响,并探讨发生该变化的机制及其重要意义。方法:将35只SD(雄性)大鼠随机分7组,中等海拔对照组5只(MC,西宁海拔2260m,温度18-20℃),高海拔组30只(H组,低压氧舱模拟海拔高度6000m,温度18-20℃),H组按预处理给药方式不同分为H1组(出仓前24小时给予精氨酸处理)和H2组(出仓前24小时给予生理盐水处理),H1和H2组根据低氧暴露时间分为1天(24小时,H1-1和H2-1组)、2天(48小时,H1-2和H2-2组)、3天(72小时,H1-3和H2-3组)共6组,每组各5只。所有大鼠分别抽取大鼠下腔静脉血标本5 ml,使用血细胞分析仪分析血常规,分离并保存血浆;采用右心导管插管法测定平均肺动脉压(m PAP);分离相应部位的肺组织,计算湿干重之比(W/D),肺组织经HE染色后观察镜下组织结构变化;提取肺组织总RNA,使用荧光RT-PCR法测定ODC1和MMP9 m RNA表达;ELISA法和Western-Blot法测定血浆和肺组织ODC1和MMP9蛋白含量,免疫组化观察ODC1和MMP9荧光蛋白表达。结果:1.低氧组第1、2、3天的WBC总数明显高于对照组,第1天和第3天H2组WBC总数高于H1组。低氧组m PAP较对照组明显升高,H2组m PAP均明显高于H1组。低氧组第3天的肺组织湿干重之比(W/D)较对照组明显升高(P<0.05)。与对照组比较,H1组肺组织HE染色可见轻度肺泡腔变形、变小、肺间质疏松、毛细血管轻度扩张;H2组肺泡腔变形、变小和肺间质增厚肿大、毛细血管扩张、充血明显。2.低氧组第1、2、3天肺组织的MMP9和第1天ODC1m RNA水平较对照组明显升高;低氧第1、3天的H2组ODC1水平较H1组明显升高,并且ODC1 m RNA水平随缺氧时间而呈现逐渐下降趋势;低氧第3天H2组MMP9 m RNA水平较H1组升高;H2组的血浆ODC1和第1、3天的MMP9蛋白水平较对照组明显增高;H2组第1、2天的ODC1和第1、2、3天MMP9蛋白水平明显高于H1组。ODC1免疫组化结果显示H1组第1天和H2组第1、2天的荧光强度明显高于对照组,H2组第1和第2天荧光强度高于H1组。MMP9免疫组化结果显示H1组第3天和H2组的荧光强度明显高于对照组,H2组高于H1组(P<0.05)。结论:1.急性低氧暴露后大鼠肺泡组织结构发生变化,肺间质增厚、毛细血管扩张、充血,外周血白细胞计数升高、平均肺动脉压力升高,肺组织的湿重增加,说明急性低氧对大鼠机体及肺组织有明显的损伤。2.急性低氧暴露后大鼠肺组织ODC1和MMP9基因的m RNA表达和蛋白水平明显增加。ODC1和MMP9基因可能参与急性低氧后的全身应激反应和肺动脉压力升高。3.L-精氨酸减轻大鼠肺组织病理变化,并可降低ODC1和MMP9基因的表达。