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心肌梗死(myocardial infarction, MI)严重影响人类生命健康,尽管目前已有多种治疗措施应用于MI的治疗,但对于梗死区坏死心肌或无功能心肌仍没有理想的治疗办法。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是干细胞研究领域中最引人注目的一种成体干细胞。MSCs取材方便、来源极广,具有增殖性强、向多种细胞系分化的能力,移植后排斥反应较少,而且易被外源基因修饰,具有向损伤部位“归巢”和旁分泌的功能。研究表明MSCs移植有可能取代受损心肌细胞,促进血管新生,减少梗死面积,改善血流供应,促进缺血心脏功能恢复。然而研究表明干细胞移植的临床效果并不满意,其中移植细胞在缺血组织中不能长期存活是重要原因之一。因此,通过基因修饰提高移植细胞在缺血组织中的黏附、生存能力,为移植干细胞的生存、分化提供条件,将在基因治疗相关研究领域中具有重要意义,有可能为基因调节干细胞功能并最终长期调控动物模型生物学特性创造条件。血管生成素-1(Angiopoietin-1, Ang-1)作为生长因子超家族的一员,主要作用于内皮细胞,参与血管新生、成熟的调控,在缺血性疾病的治疗中发挥着重要作用。Ang-1调节血管生成、功能的作用主要表现在如下几个方面：1、提高血管内皮细胞的存活力,抑制细胞凋亡,减少血管萎缩和退化的发生,促进缺血组织周围侧枝循环的形成；2、加强内皮细胞间的紧密连结,稳定血管,防止渗漏；3、抑制内皮细胞炎症反应,减少内皮细胞损伤,控制动脉粥样硬化进程。但Ang-1基因修饰MSCs能否发挥协同治疗作用改善MI后心功能?其对心功能调节的分子生物学机制是什么?对此目前尚未阐明。据此,本研究中拟运用慢病毒载体,将Ang-1基因转导至MSCs,观察基因与细胞联合移植在大鼠MI后心肌、血管修复中作用,并探讨其可能机制。整合素是细胞表面的黏附分子受体,包括α及β两类。经由整合素介导的细胞信号传导具有双向性的特点。近年来,国外有学者指出Ang-1通过心肌细胞表面的整合素可达到促进心肌细胞生存,抑制细胞凋亡的目的。研究业已证实MSCs表面存在整合素受体,但Ang-1是否能通过整合素调节MSCs的生存,抑制细胞凋亡,目前国内外尚无报道。据此,本研究拟结合整合素受体拮抗剂及信号传导通路阻滞剂,观测Ang-1经由整合素对MSCs功能的调节效应及其可能的分子生物学机制。具体实验内容包括三部分：第一部分通过构建Ang-1载体质粒,运用三质粒系统包装携带Ang-1基因慢病毒载体,探讨慢病毒介导Ang-1基因修饰大鼠MSCs (rMSCs)的可行性及表达的稳定性。方法：制备感受态大肠杆菌,转化、扩增、纯化载体质粒。脂质体转染法三质粒共转染HEK293T细胞,包装、收集携带目的基因Ang-1及报告基因EGFP的慢病毒。密度梯度离心法分离并培养、鉴定rMSCs。浓缩病毒上清液,感染2-4代rMSCs并获得转基因干细胞—-Angl-rMSCs。Western blot、免疫细胞化学及RT-PCR检测Ang-1基因和蛋白表达情况。结果：成功运用慢病毒三质粒系统包装获得携带目的基因的慢病毒。浓缩病毒上清感染rMSCs后,空病毒载体修饰的rMSCs(pNL-rMSCs)及Ang-1病毒载体修饰的rMSCs (Angl-rMSCs)均可检测到绿色荧光表达,Ang1-rMSCs可成功表达Ang-1蛋白。结论：成功构建Angl-rMSCs组织工程学干细胞,该基因修饰干细胞可持续稳定分泌Ang-1蛋白。第二部分构建F344近交系大鼠MI动物模型,通过将Angl-rMSCs移植入MI周边区,观察基因修饰rMSCs移植对MI后大鼠心肌细胞的分化、血管新生及细胞凋亡、梗死面积和心功能的影响。方法：结扎大鼠冠状动脉左前降支,构建大鼠MI模型。实验分为假手术组、单纯手术组、Angl-rMSCs组及pNL-rMSCs组。模型建立后1h在心梗周围,进行细胞注射移植。分别于细胞移植术后7天及28天行心脏彩色超声心动图检测心功能和血流动力学参数评估；于移植后3天、14天、60天荧光显微镜观察MSCs移植后分布情况;免疫荧光染色观察心肌细胞分化情况；RT-PCR及ELASA法分别检测心肌组织中Ang-1 mRNA的表达及Ang-1蛋白浓度；Masson染色测定梗死面积；Tunel染色检测细胞移植后细胞凋亡情况；α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle specific actin,α-SM)及血管性血友病因子(Von Willebrand factor, vWF)染色观察血管新生情况。结果：MI动物模型建立后3天、14天、60天Angl-rMSCs和pNL-rMSCs移植组心脏组织均可见EGFP阳性细胞。术后第28天,Angl-rMSCs移植周边心肌组织可检测到较高浓度Ang-1表达,心肌特异性抗原染色cTNI阳性。pNL-rMSCs组较单纯手术组梗死面积减少(P<0.05),而Angl-rMSCs组较pNL-rMSCs组梗死面积进一步减少(P<0.05)；Ang1-rMSCs组较pNL-MSCs组及单纯手术组的Tunel阳性细胞显著减少(P<0.05)；Ang1-rMSCs移植组较pNL-MSCs组及单纯手术组a-SM阳性细胞和vWF阳性细胞显著增多(P<0.05)。与pNL-MSCs及单纯手术移植组相比,Ang1-rMSCs组移植后7天和28天左心室舒张末期内径(LVEDD)明显缩小(P<0.05),左心室后壁厚度(LVPWD)明显增厚(P<0.05)；左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)明显增加(P<0.05)；术后28天,左心室收缩压(LVSP)、左心室等容收缩期室内压最大上升速率(+dp／dt)以Angl-rMSCs组最高、pNL-rMSCs组次之,单纯手术组最低；而左心室舒张末压(LVEDP),左心室等容舒张期室内压最大下降速率(-dp／dt)则相反以单纯手术组最高,pNL-rMSCs次之,Ang1-rMSCs组最低。结论：Angl-rMSCs组织工程学干细胞移植可显著促进血管新生,且部分移植细胞能够分化表达心肌细胞的标志物,抑制心肌细胞凋亡,减少梗死面积,改善MI大鼠术后心功能。第三部分Ang-1经由整合素通过PI-3K／Akt及Bcl-2抗MSCs凋亡机制的探讨。方法：分离、培养rMSCs; Ang-1包被24孔细胞培养板测定Ang-1对rMSCs的黏附作用；紫杉醇诱导rMSCs凋亡,运用Hoechst染色法和Annexin V/PI法检测细胞凋亡,运用Western blot及整合素抗体(β1抗体)和PI-3K／Akt信号转导阻滞剂wortmannin等,观察Ang-1对pAkt及Bcl-2表达的调节,探讨Ang-1抗rMSCs凋亡的可能分子机制。结果：(1)Ang-1可显著促进rMSCs的黏附,该效应可被乙二胺四乙酸(EDTA)、整合素亚单位β1抗体和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(Arg-Gly-Asppeptide, RGD)抗体所抑制。(2)Ang-1能拮抗紫杉醇诱导的细胞凋亡,该效应可被RGD抗体抑制。(3)Ang-1可上调pAkt和Bcl-2表达；RGD抗体能抑制二者的表达；PI-3K／Akt通路传导阻滞剂wortmannin可抑制pAkt的表达,而对Ang-1作用下的Bcl-2表达上调无抑制作用。结论：Ang-1可经由整合素促进细胞的黏附、抑制MSCs凋亡,这一效应可被RGD抗体、EDTA、β1抗体所抑制；Ang-1经由整合素调节pAkt及Bcl-2表达,可能是其调节MSCs抗凋亡的机制之一。