中药是中华民族的瑰宝,在中华民族的繁衍和发展中扮演了非常重要的角色。目前,运用中药和一些天然小分子物质来治疗肿瘤已经越来越受到医疗界的青睐。中药在肿瘤治疗过程中具有调节机体免疫功能,减轻化疗毒副作用,改善患者生存质量等特点,所以中药在肿瘤治疗中具有独特的优势。然而,由于中药成分复杂,在治疗疾病过程中治病机理并不完全明确,以至于中药大规模临床应用和推广困难重重。调节性T细胞(Treg)是T淋巴细胞中一类具有特殊免疫调节功能的细胞,在肿瘤的发生、发展过程中扮演着极其重要的角色,其具有自身免疫、免疫耐受和免疫抑制功能,可以在多种机制的协同作用下调机体的抗肿瘤免疫。因此,中药复方作为中国传统中药的精髓所在,如果能在恶性肿瘤治疗过程中,通过调节抑制Treg细胞来打破肿瘤免疫耐受和提高机体免疫力,将为中药对肿瘤的治疗提供新思路。苓甲抗癌复方已经在临床运用多年,在肝癌、乳腺癌患者治疗中可改善症状,提高生存质量和延长生存期,但其治病机理尚不清楚,所以本实验旨在探索苓甲复方的抗癌机理。本实验室前期体外实验结果表明,苓甲复方的提取物(LAM)可以抑制肿瘤细胞增殖,抑制NF-κB信号通路的活化和下游基因的表达,使肿瘤细胞周期阻断在Go/G1期最终诱导肿瘤细胞凋亡。在此基础上,本论文主要探究了LAM在小鼠体内实验中探索小鼠体内免疫功能的改变对抗肿瘤免疫的影响。通过传统的中药熬制法获得中药粗提物,然后经45%乙醇和80%乙醇液相提纯得到提取物LAM保存待用。为了探究小鼠体内LAM抗肿瘤机制,实验分三部分进行。首先,评价LAM对小鼠的毒性,将小鼠随机分为四组,以三个不同浓度(0.5 g/Kg、1 g/Kg、2 g/Kg)的LAM灌胃小鼠,连续14天后发现小鼠正常生长,各组均未见小鼠死亡,按照毒理学评价标准LD50>2 g/Kg。对各组小鼠肝脏和肾脏的HE染色,显示两个低浓度组对肝肾无损伤,高浓度组有较弱损伤,说明该复方提取物对小鼠有较低的毒性。其次,观测LAM抑制小鼠肿瘤生长效果。我们构建了BALB/c-4T1小鼠乳腺癌模型。实验分为六组：正常组(Normal)、荷瘤对照组(Control)、预防组(Pre-0.5 g/Kg)、治疗组一(0.5 g/Kg)、治疗组二(1 g/Kg)、阳性对照环磷酰胺组(CPM-10mg/Kg)。结果发现预防组、治疗组和CPM组明显抑制肿瘤的生长,抑瘤率分别为67.9%、61.54%、67.45%和43.08%；HE染色和Ki67染色结果表明LAM可促进肿瘤坏死和抑制Ki67的表达。在以上实验的基础上重点测定LAM对小鼠免疫功能的影响。通过流式细胞术检测CD4+CD25+FOXP3+与CD4+CD25+CD127来观察Treg细胞的数量,结果发现预防组、治疗组、CPM组对Treg细胞抑制效果明显；ELISA实验表明,LAM明显抑制了血清与淋巴细胞培养液中中IL-10和TGF-P的分泌,并且通过Western blotting证实经过治疗后FOXP3和CTLA-4的表达明显受到抑制；通过检测荷瘤小鼠中由Treg细胞引起的免疫耐受对T细胞增殖、T细胞亚群CD4/CD8、NK细胞的影响,发现经LAM治疗后可以提高淋巴细胞的增殖、使CD4/CD8趋于正常和NK细胞的比例增多,ELISA结果也表明IL-2和IFN-γ的分泌明显增加,并使穿孔素和颗粒酶B的分泌明显增加。综上所述,通过体内实验证实LAM可以明显抑制肿瘤的生长,并通过抑制Treg细胞的数量与功能,打破由Treg细胞所引起的免疫耐受进而提高机体的免疫功能,发挥机体正常的抗肿瘤免疫。本实验探讨了苓甲复方发挥抗肿瘤作用的一种可能的机制,为苓甲抗癌复方临床应用提供了理论支持。