人肠道病毒D68型(Human enterovirus D68,EV-D68)属于小RNA病毒科、肠道病毒属。1962年,EV-D68在美国加利福尼亚州患有严重呼吸道感染的儿童鼻咽拭子中首次被发现,EV-D68可在儿童中引起严重的呼吸系统疾病,严重患者会出现急性弛缓性瘫痪等神经系统疾病,甚至导致死亡。近年来,EV-D68在全球各地频繁暴发。2014年,在美国发生了迄今为止规模最大的EV-D68感染,确诊病例1153例,死亡14例。然而目前对于EV-D68的研究较少,并且缺少特效的疫苗和有效的治疗手段来应对EV-D68感染。因此,对EV-D68进行分子生物学、复制机制和致病机理等深入的研究显得极为重要。利用反向遗传学技术可以在DNA水平对RNA病毒进行改造,从而研究RNA病毒基因组的结构与功能,为病毒的复制机制以及致病机理提供了方法。本研究构建了EV-D68 Fermon病毒株的反向遗传操作系统,包括EV-D68微复制子和EV-D68感染性克隆。微复制子是利用萤火虫荧光素酶报告基因替换EV-D68基因组编码区构建而成,并分别利用T7 RNA聚合酶和人RNA聚合酶I(Pol I)拯救微复制子。我们发现Pol I启动子在拯救微复制子上效率要高于T7启动子。其次,通过微复制子,我们证明了EV-D68病毒蛋白的翻译依赖于病毒非编码区的功能,并发现3’poly(A)尾长度会影响微复制子的转录。因而,我们利用Pol I聚合酶系统成功构建感染性克隆。将重组质粒转染RD细胞可以获得拯救病毒。利用分子生物学技术分析确定拯救病毒是由转染重组质粒获得。通过对比拯救病毒和母本病毒的蚀斑形态以及增殖曲线,我们发现了G394C突变将会降低病毒蛋白翻译水平,导致病毒增殖能力下降。反向遗传系统的建立为寻找EV-D68毒力位点,深入研究EV-D68致病机理以及EV-D68抗病毒药物和疫苗的研发奠定了基础。