论文部分内容阅读
脑卒中是目前全球第二大致死性疾病且致残率最高,给患者和家庭带来沉重的负担。溶栓疗法一直是急性血管梗死的速效治疗方法,但溶栓后所致的脑缺血再灌注损伤与脑缺血疾病的预后和后遗症的形成和治疗有密切关系,该问题也日趋受到重视。现有抗脑缺血再灌注损伤的神经保护药物种类较少,亟需寻找更为有效的治疗药物。5-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)罗丹宁(RD-1),是在罗丹宁的化学结构基础上进一步修饰合成的新型化合物,已经获得国家发明专利授权。我们前期的实验表明,RD-1能显著对抗MPTP诱导的多巴胺能神经元损伤毒性,可能通过改善线粒体功能障碍发挥抗帕金森病的脑保护作用。而线粒体功能障碍是多种神经性疾病共同的病理生理基础,也是脑缺血再灌注损伤中神经元细胞死亡的原因之一。因此我们推测是否RD-1也可能通过改善脑缺血再灌注损伤所致的线粒体功能障碍,从而发挥抗脑缺血损伤的神经保护作用。本研究的目的即:采用氧糖剥夺后复灌(OGD/R)模型模拟体外脑缺血再灌注损伤,进而采用大鼠大脑中动脉梗阻(MCAO)2h后复灌造成体内急性脑缺血再灌注模型,观察RD-1对抗脑缺血再灌注损伤的保护作用,并从组织水平、细胞水平、分子水平等多层面探讨RD-1的作用机制,为其临床应用转化提供理论基础。第一部分5-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)罗丹宁抗脑缺血再灌注损伤药效学研究1.在大鼠原代皮层神经元细胞上建立OGD/R模型,1、5及10μM的RD-1作用48 h后可以显著对抗Na2S2O4诱导的细胞损伤,提高细胞活性(P<0.05)。2.建立大鼠MCAO模型并2h后复灌,连续给药14d后确认药效。RD-1可显著降低大鼠神经功能缺损症状评分(P<0.05),显著缩短大鼠去除两侧前肢贴纸的时间(P<0.05),显著改善MCAO损伤所致的大鼠精神状态异常(P<0.05)。在平衡杆实验中一定程度上缩短大鼠过杆总时间,但未有统计学差异。MCAO损伤对于大鼠的自发运动能力及学习记忆能力并无显著影响。3.HE染色结果显示,大鼠大脑在MCAO损伤14 d后脑梗死体积显著增加(P<0.01);各给药组经过14d治疗后能够明显降低脑梗死体积(P<0.05)。4.对MCAO大鼠大脑损伤侧皮层NeuN阳性细胞计数进行统计,结果显示,RD-1可显著抑制MCAO大鼠的损伤侧大脑皮层前肢感觉区神经元的丢失(P<0.01)。各组之间正常侧大脑皮层前肢感觉区单位面积内NeuN阳性神经元数量无明显变化。第二部分5-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)罗丹宁抗脑缺血再灌注损伤作用机制研究1.OGD/R损伤可诱导大鼠原代皮层神经元内活性氧大量生成(P<0.001),线粒体膜电位显著下降(P<0.001),同时细胞内出现明显的钙超载现象(P<0.01);而RD-1可明显减轻OGD/R造成的线粒体损伤,显著抑制活性氧的过量生成(P<0.001),稳定线粒体膜电位(P<0.001),并减轻细胞内钙超载(P<0.05)。2.OGD/R损伤的大鼠原代皮层神经元中线粒体分裂蛋白DRP1无明显变化,但线粒体融合蛋白OPA1的表达显著下调(P<0.01),RD-1给药可显著提高OPA1的表达(P<0.05)。3.对大鼠损伤侧皮层组织蛋白水平的检测结果显示,MCAO损伤14 d后线粒体分裂蛋白DRP1、线粒体融合蛋白OPA1和MFN2均显著下调(P<0.05,P<0.01,P<0.001),而RD-1各给药组可显著增加上述3个蛋白的表达水平,从而对抗MCAO损伤所致的线粒体分裂及融合障碍。4.MCAO损伤14 d后大鼠损伤侧皮层组织中线粒体自噬标记蛋白Beclin1的表达明显降低(P<0.001),且LC3-Ⅰ型向Ⅱ型转变比例降低(P<0.001);RD-1可通过激活PINK1/Parkin通路和Nix通路,促进神经元内线粒体自噬过程。5.线粒体轴突转运实验结果显示,OGD/R损伤引起线粒体轴突转运障碍,表现为顺向转运减慢,逆向转运加快(P<0.001);RD-1可显著加快线粒体的顺向转运(P<0.001),减慢逆向转运(P<0.001)。同时体内外western blot实验均证明RD-1可改善损伤后线粒体顺向转运单位复合物中驱动蛋白KIF1B和受体蛋白Miro2的表达(P<0.05,P<0.05)。6.大鼠原代皮层神经元囊泡释放实验结果显示,在限定的同一时间段内,OGD/R组释放神经递质显著减少(P<0.01),表明OGD/R损伤引起突触囊泡神经递质释放的障碍,RD-1可以显著逆转这一障碍(P<0.05)。同时,体内外western blot实验均证明RD-1可改善损伤后突触小体相关蛋白SNAP25和Complexin-1/2的表达(P<0.05)。7.大鼠原代皮层神经元TUNEL染色结果表明,OGD/R损伤诱导细胞凋亡比率增加,RD-1给药后可大幅降低凋亡水平。8.体内外Western blot实验结果均显示缺血再灌损伤可改变细胞内凋亡相关蛋白的表达:显著降低Bcl-2蛋白的水平(P<0.05),升高Bax蛋白的表达(P<0.01),因而降低Bcl-2/Bax的比例(P<0.05);RD-1在体外可明显改善上述变化(P<0.05,P<0.01,P<0.05),抑制凋亡;在体内RD-1虽对Bcl-2的表达变化无明显影响,但可显著降低Bax蛋白的表达水平(P<0.05),并提高Bcl-2/Bax的比例(P<0.01),抑制凋亡。综上,RD-1在体内外脑缺血再灌注损伤模型中均表现出良好的神经保护作用,可显著改善缺血再灌所致的线粒体功能障碍,减轻线粒体损伤,维持线粒体稳态,促进突触囊泡之间神经递质的释放,同时抑制神经元的凋亡。RD-1有望成为新的脑卒中临床治疗药物,本研究为RD-1抗脑缺血再灌注损伤作用的开发积累了一定的实验基础和理论依据。