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卵巢癌是当今女性生殖系统三大恶性肿瘤之一;由于卵巢位于盆腔深部;早期病变不易发现;易发生远处转移与扩散;晚期病例也缺乏有效治疗手段;以及术后易复发和化疗易耐药的特点;其病死率长期位居妇科恶性肿瘤之首;严重威胁女性的健康和生命。明确卵巢癌转移的机制及对铂类药物耐药问题将有助于降低卵巢癌患者病死率。 NANOG基因是在研究多能干细胞上发现的标志因子;对维持干细胞自我更新、细胞增殖等都起着关键作用。由于肿瘤干细胞与多能干细胞有很强的相似性;近年该基因与肿瘤相关的研究较多。已证实NANOG参与肿瘤发生发展过程的多个环节。NANOG能够参与正常细胞恶性转化;维持肿瘤干细胞自我更新;调控肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭;以及促进肿瘤免疫逃逸。NANOG在肿瘤中的多重作用可能是推动肿瘤发生发展的重要因素;有报道;NANOG基因在肝癌细胞的耐药中起着关键作用;并证实可以调控MDR1 mRNA表达水平;抑制NANOG基因表达后;可以导致细胞内MDR1的mRNA表达水平下降;提示可能对多药耐药基因的调控有着重要的调节作用。NANOG基因可能是通过影响外排泵形式在耐药方面发生作用的。然而;NANOG基因对卵巢癌的生物学作用及对耐药是否有影响研究较少。 因此;本研究旨在通过观察NANOG基因对卵巢癌细胞表面标志的影响;进一步观察其对细胞迁移及侵袭等运动能力的影响;探寻其在卵巢癌细胞转移过程中的可能作用;另外通过观察NANOG基因对卵巢癌细胞化疗的敏感性及耐药基因的变化;揭示NANOG基因在卵巢癌耐药中的可能机制。本研究论文分为四部分： 第一部分 NANOG基因的表达与沉默对卵巢癌细胞表型的影响 目的：观察NANOG基因表达对卵巢癌细胞及正常卵巢上皮细胞表型的影响;推测NANOG基因在EMT过程中的可能作用。 方法：以卵巢癌细胞SKOV-3和正常卵巢上皮细胞MOODY作为观察对象;通过Western Blot检测二者细胞表面E-cadherin;N-cadherin的表达水平;采用小干扰RNA（Small interfering RNA;siRNA）沉默SKOV-3细胞内的NANOG基因;而采用pcDNA3.1-NANOG质粒在MOODY细胞过表达NANOG基因。干预成功后Western Blot重新检测二者细胞表面E-cadherin;N-cadherin的表达水平。 结果： 1. SKOV-3 细胞表现出很强的间质细胞特征;表达 Vimentin; N-cadherin; 及Fibronectin;但不表达上皮细胞标志E-cadherin。 2. MOODY细胞表达很强的上皮细胞标志E-cadherin;但不表达间质细胞标记N-cadherin。 3. NANOG基因在SKOV-3细胞中表达明显强于MOODY细胞。 4. MOODY细胞中在NANOG基因高表达后出现了E-cadherin下调;和N-cadherin上调。 5. SKOV-3细胞中在NANOG基因沉默表达后;出现N-cadherin下调和E-cadherin上调。 结论：NANOG基因表达可使E-cadherin下降;N-cadherin增加;表明NANOG基因能控制卵巢癌细胞表面标志;可能影响EMT的过程。 第二部分 NANOG基因对卵巢癌细胞侵袭与迁移的影响 目的：通过沉默与过表达NANOG基因观察NANOG基因对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响。 方法：采用siRNA沉默封闭SKOV-3细胞内的NANOG基因;采用pcDNA3.1-NANOG质粒转染技术使NANOG基因在MOODY细胞中过表达;进行迁移及侵袭试验前后对比。实验重复3次;统计学采用SPSS20.0软件处理;t检验分析;P<0.05认为有显著性差异。 结果： 1.体外跨膜迁移实验中;MOODY细胞过表达NANOG基因后;细胞迁移能力明显高于空载体对照细胞（OE-FF Luc 34.6±6.2 vs OE-NANOG 193.2±9.7）。 2.体外跨膜迁移实验中;SKOV-3细胞经siRNA沉默NANOG基因表达后;与对照组相比其迁移能力明显下降（siRNA-Rella Luc 878.3±12.6 vs siRNA-NANOG 79.1±5.6）。 3.体外跨膜侵袭实验中;MOODY细胞过表达NANOG基因后;细胞侵袭能力明显高于空载体对照细胞（OE-FF Luc37.3±5.2 vs OE-NANOG 176.2±8.7）。 4.体外跨膜侵袭实验中;SKOV-3细胞经siRNA下调NANOG基因表达后;细胞侵袭能力出现了下降（ siRNA-Rella Luc884.7±16.7 vs siRNA-NANOG 56±6.0）。 结论：NANOG的表达能调节MOODY细胞及SKOV-3细胞的迁移及侵袭能力;NANOG基因参与了卵巢癌细胞的迁移及侵袭过程。 第三部分 NANOG基因对卵巢癌细胞耐药的作用机制 目的：观察NANOG基因沉默与表达后卵巢癌细胞对顺铂敏感性的影响及可能存在的耐药机制。 方法： 1. 分别采用siRNA沉默SKOV-3细胞中NANOG基因的表达; pcDNA3.1-NANOG质粒转染额外表达MOODY细胞中NANOG基因的表达。采用顺铂敏感性实验;通过MTT[3-(4;5-dimethyl-2-thiazolyl)-2;5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide;3-(4;5-二甲基噻唑-2)-2;5-二苯基四氮唑溴盐]方法检测细胞残存活性。SPSS 20.0软件预测药物半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration;IC50）;实验重复三次(n=3);并进行统计学处理;采用IC50 均数±标准差进行比较;P<0.05认为有显著性差异 2. 采用 Western blot 及实时荧光定量 PCR （ QT-PCR ）方法检测NANOG基因干扰前后NANOG及MDR1表达水平;并对两者相关性进行分析;QT-PCR采用2?ΔΔCt法。 3. 采用克隆形成培养体系分析NANOG变化对克隆形成能力的影响;SPSS 20.0软件处理;t检验分析结果;P<0.05认为有显著性差异。 结果： 1. 未转染MOODY细胞组中IC50为11 ± 5 μg/ml;单纯荧光素载体对照组中 IC50为14 ± 1 μg/ml;两者差异无统计学意义（P>0.05）。 2. NANOG过表达质粒转染MOODY细胞组中;IC50值高达49 ± 4 μg/ml;明显高于对照组（P<0.05）。 3. 未沉默NANOG的SKOV-3细胞组IC50 76 ± 2 μg/ml;单纯荧光素载体对照组IC50为75 ± 1 μg/ml;两者差异无统计学意义（P>0.05）。 4. 沉默NANOG的SKOV-3细胞组IC50值则为53 ± 4 μg/ml;明显低于其他两组（P<0.05）。 5. QT-PCR检测发现MOODY细胞中NANOG表达低于SKOV-3细胞内的表达;MDR1基因表达亦低于SKOV-3细胞内表达。 6. 将pcDNA3.1-NANOG质粒转染MOODY细胞后MDR1基因随NANOG基因的表达增加出现上升;蛋白水平亦随之增高。 7. 经siRNA沉默NANOG后;SKOV-3细胞的NANOG基因表达下降;MDR1基因表达亦下调;同时Western Blot显示蛋白水平下调。 8. NANOG对卵巢癌细胞的克隆形成能力的影响：转染NANOG特异性质粒的MOODY细胞克隆数(2.7±1.5)与未转染细胞形成克隆数(2±1)未出现明显差别(P=0.28) ;而转染特异性NANOG干扰RNA的SKOV-3细胞(17.6±4.5)与对照转染相比（17.3±5.5）;也没有出现明显克隆数变化(P=0.47) . 结论：NANOG基因表达能降低卵巢癌细胞对顺铂的敏感性;出现耐药;其机制是NANOG影响了MDR1的表达;可能通过外排泵作用导致耐药;并非通过改变卵巢癌细胞的克隆形成能力所致。 第四部分 NANOG在卵巢癌患者组织中的表达及临床意义 目的：观察卵巢癌患者组织中NANOG表达与临床病理间的关系。 方法：经伦理及患者知情同意;根据纳入及排除标准选取34例上皮性卵巢癌患者;其中铂类药物敏感组16例;耐药组18例;进行临床资料分析;并进行病理切片免疫组化染色。分析NANOG表达与临床指标之间的相关关系。采用t检验分析相应组有无统计学差异。P<0.05提示有统计学差异。 结果： 1.免疫组化方法分析组织标本中NANOG的表达。18例耐药患者NANOG表达的阳性细胞百分数77.05±8.2%;而敏感组16患者中NANOG的阳性细胞百分数15.19±3.9%。二者有明显区别（P<0.05）。 2.绝经后患者20例NANOG阳性细胞百分数在43.35±29.56%;绝经前患者14 例NANOG阳性细胞百分数为53±28.5% 二者无明显差别P=0.397 3.肿瘤分期I+II共12例NANOG阳性细胞百分数29.3±21.56%；III+IV期22例NANOG阳性细胞百分数57.14±28.3%;二者有显著差异 P=0.005 4.淋巴结转移阳性组患者（ n=13 ）中NANOG阳性细胞百分数为50.46±31.13%;淋巴结转移阴性组患者中(n=21);NANOG阳性细胞百分数为45.38±28.38%;二者无明显差异;P=0.63. 结论：铂类耐药组卵巢癌患者组织中NANOG表达高于铂类敏感组患者。临床分期与NANOG表达有关;分期越晚表达水平越高;但与绝经前后、有无淋巴结转移无关。提示NANOG基因表达与卵巢癌患者铂类耐药有关;通过NANOG检测可有助于判断患者预后;对治疗卵巢癌具有指导意义;并提供可行的新的分子治疗靶点。