背景：毒蛇咬伤是一世界性的普遍问题，据WHO有关材料表明，目前世界上每年估计约有50万人遭受毒蛇咬伤。我国已知有毒蛇48种，毒蛇咬伤主要发生在南方地区，我省素有养蛇、食蛇的生活习惯，毒蛇咬伤甚为突出，据国家卫生部资料显示，南方几省近5年毒蛇咬伤危重病人：伤18万人、死亡2.5万人，蛇咬伤病人每年以3％的速度逐年上升，不亚于交通事故伤，已构成城乡医院常见急诊之一<'[1]>。传统的蛇伤治疗是精制的抗蛇毒血清，由于该制剂中的马源lgG系异种蛋白，故常发生过敏反应，一般多见的有皮疹、喉头水肿、血压下降，四肢关节疼痛、血清病、过敏性休克等Ⅲ型变态反应<'[2]>。近年来用原始、脱毒或丫射线照射(γ-irradiated)的蛇毒作抗原，免疫母鸡后12～15天，即可从鸡卵黄中分离出相应的免疫球蛋白(Immunoglobulinyolk，简称IgY)。与现有的马血清lgG相比，IgY具有产率高、成本低、稳定性好、特异性强、过敏性小及显著减少由于抗体采集而造成对动物的伤害<'[3]>等优点，因此，IgY已成为新一代蛇伤特效药物研制的一个重要方向。 目的： 制备抗眼镜蛇毒鸡卵黄抗体(简称：抗眼镜蛇毒IgY)，探索制备高效价抗体的免疫方案；优化纯化方法，开发鉴定抗体特性的新方法；为替代马源性抗蛇毒血清奠定基础。 方法： 一、抗眼镜蛇毒IgY的制备、纯化 1、抗眼镜蛇毒lgY的制备优化免疫方案，利用本所专利-蛇毒取毒器制备抗原眼镜蛇毒，以小剂量眼镜蛇毒粗毒与福氏佐剂混合制成油包水的乳状颗粒，免疫产蛋率高的莱杭母鸡，以间歇、逐渐加量的加强免疫方案制备抗眼镜蛇毒IgY抗体。 2、以间接ELISA法检测特异性IgY抗体效价的动态变化；双向免疫扩散和免疫电泳鉴定卵黄中的特异性抗体；SDS-PAGE测定各级纯化抗体产物的纯度。 3、抗眼镜蛇毒IgY的纯化采用本实验过程中发明的卵黄分离收集器从卵清中分离出卵黄，用水稀释法粗提IgY抗体，采用硫酸铵沉淀，阴离子交换层析，嗜硫色谱，疏水色谱，凝胶层析及辛酸-硫酸铵沉淀等多种纯化方案提取、纯化抗体，并与商业上的EGG STRACT纯化试剂盒进行纯度、回收率及效价方面的比较，探索纯化方法，优化纯化方案。 二、抗眼镜蛇毒IgY的免疫特性研究 1、利用双向免疫扩散法测定抗眼镜蛇毒IgY与中国常见9种蛇毒的交叉免疫反应及其反应强度，并与精制马源性抗眼镜蛇毒血清作了效价比较。用免疫印迹法比较IgY与马源性抗体的免疫特性。 2、优化SDS-PAGE法的实验条件，用于测定IgY抗体与眼镜蛇毒的最佳反应浓度比例，测定IgY抗体的热稳定性、酸碱稳定性及抗体交叉反应特性。利用The ImageQuant TL 1D分析SDS-PAGE蛋白条带。 三、抗眼镜蛇毒lgY的生物活性研究 1、抗眼镜蛇毒IgY对小白鼠的保护作用小鼠体外中和实验检测所制IgY的生物活性； 2、鸡血清抗体对自身的保护作用第一次免疫40周后，4倍LD<,50>眼镜蛇毒攻击已免疫母鸡，ELISA检测攻击前后鸡血中抗体效价变化并观察蛇毒注射局部病理变化情况，未经眼镜蛇毒免疫的母鸡作阴性对照。 3、建立眼镜蛇伤/IgY抗体保护模型利用BL-420F生物机能实验系统测定模型(大鼠)的呼吸、心率、心电以及血压等生理指标变化；利用Olympus 2700大型生化分析仪检测大鼠的心、肝、肾主要功能酶及有关生化指标的变化。 四、统计采用t、X<'2>检验，SPSS软件等统计分析实验数据。 结果： 1、利用蛇毒取毒器制备的蛇毒活性高，含杂质量少。用眼镜蛇毒粗毒、初次小剂量免疫后，经ELISA法卵黄中第7天(双向免疫扩散法第13天)即可检测到特异性卵黄抗体。经间歇、逐渐加量加强免疫，抗体效价持续增高，达到较高水平(128000)后呈生物节律性波动并维持高效价直到第40W。 2、实验过程中发明卵黄分离收集器(专利号：2006200559807.3)，利用此仪器收集试验用卵黄，卵清、卵黄分离度高，卵黄膜光洁、完整，卵清残留量少，有利于下一步的分离纯化。 3、水稀释法去脂效果好，进一步经硫酸铵盐析后，蛋白回收率为40．36％，再经阴离子交换层析，总蛋白回收率14.86％，效价提高24倍。辛酸-硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体，回收率为88.2mg/egg，纯度可达电泳纯，效价比EGG Stract试剂盒纯化的抗体高2倍。经嗜硫色谱、疏水色谱及凝胶层析等方法纯化的抗体，尚含有一定的杂蛋白，有待进一步优化条件，以期得到纯度更高的抗体。 4、经双向免疫扩散法测定，所制抗眼镜蛇毒IgY与眼镜蛇、眼镜王蛇反应最明显，从反应沉淀线上两者无明显区别，与眼镜蛇科的其他蛇毒有相对较弱的交叉反应；与国产圆斑蝰及缅甸蝰也有交叉反应，与国产圆斑蝰的反应强于缅甸蝰；与蝮蛇科大部分蛇毒无交叉反应。与马源性抗眼镜蛇毒血清相比，免疫沉淀线在形态和数量上有一定的区别，可能与两种抗体的特性有关。抗眼镜蛇毒IgY能与蝰蛇毒反应，形成相对较弱的免疫沉淀线，而马源性抗眼镜蛇毒血清与蝰蛇毒反应，无肉眼可见的免疫沉淀线形成。 5、通过免疫印迹反应，发现所制lgY与马源性抗眼镜蛇毒血清在与眼镜蛇毒的抗原反应条带方面存在一定的差别。 6、通过SDS-PAGE，测定所制IgY与眼镜蛇毒的最佳反应比(w/w)为2/2∶1，抗体在70℃以下活性稳定，保持最佳活性的pH值是6～8，有效pH值范围为3～12，与眼镜蛇科的银环蛇毒等有一定的交叉反应，与缅甸蝰蛇毒及蝮蛇科的五步蛇毒等交叉反应不明显。 7、体外中和实验表明，7.44 mg的IgY抗体可以完全保护实验小鼠免受4倍LD<,50>眼镜蛇毒的攻击；同时，鸡血清中也保留着较高效价的抗体，可中和4倍LD<,50>以上的眼镜蛇毒。 8、建立眼镜蛇伤/IgY抗体保护模型，经腹腔注入挑战剂量(4倍LD<,50>：40.64mg/kg)的中华眼镜蛇毒，人鼠平均生存时间为3±0.33h。蛇毒组给药30～60min后，心率及呼吸频率均有轻度加快，Ⅱ导联ST段抬升幅度超过同期正常对照0.1mV以上(P<0.05)；130～150min后，心率、呼吸频率及动脉血压均直线下降；达180min时，心率、呼吸频率及动脉血压均已降到同期正常对照的30％以下，差异显著(P<0.01)。IgY保护组给药后各指标相对平稳，与对照组无明显差别。蛇毒组心功能酶(CK、CK-mb)，肝功能酶(AST、Alt，Tbil)和肾功能(BUN、Cr-2、Ua)较IgY保护组和对照组都显著增高(P<0.05)，而抗体保护组和对照组比较，变化不明显(P>0.05)。 结论： 1、首次以眼镜蛇毒粗毒免疫莱杭母鸡，经初次小剂量、间歇、逐渐加量加强免疫，可持续40w获得含有高效价、特异性抗体的鸡卵。 2、发明的卵黄分离收集器可批量分离卵黄，在工业化生产IgY方面有较好的应用前景。 3、经水稀释法粗提抗体，硫酸铵沉淀再联合阴离予交换层析纯化抗体，所得抗体纯度较高，抗体活性好；经水稀释法粗提抗体，辛酸-硫酸铵沉淀纯化的抗体，纯度可达电泳纯，抗体回收率高、活性好，纯化方法经济、简单易行，可与商业的纯化试剂盒相媲美。 4、利用SDS-PAGE测定IgY的抗体特性、理化特性等，简单快捷，结果可靠。 5、以4倍LD<,50>为挑战剂量造模的中华眼镜蛇伤大鼠模型，心率、血压、呼吸频率及心电图等电生理指标的动态变化和主要器官功能指标与临床症状基本相符。抗眼镜蛇毒IgY可有效地中和、保护眼镜蛇毒对机体的伤害。 6、本实验为抗眼镜蛇IgY的应用及其它抗蛇毒IgY的制备奠定了基础。