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本文主要从以下几个方面进行论述: 目的:构建、拯救甲型H7N9流感病毒疫苗候选株，并制备注射用甲型H7N9流感裂解疫苗和喷鼻甲型H7N9流感减毒活疫苗，动物实验评价两种疫苗的免疫原性及免疫保护效果。 第一部分注射用甲型H7N9流感裂解疫苗的制备及免疫效果评价 方法:采用反向遗传学技术，以A/Puerto Rico/8/34（PR8）毒株做为骨架病毒，将其6个内部基因(PB1、PB2、NP、PA、M、NS)及A/Anhui/1/2013(H7N9)疫苗株的HA、NA基因分别构建到双向表达载体pHW2000上，共转染细胞MDCK～COS1后，拯救筛选获得甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9，经放大培养、超滤浓缩、蔗糖纯化等工艺制备甲型H7N9流感裂解疫苗抗原。制备7.5μg、15μg、30μg和45μg四个不同剂量疫苗抗原，腹腔注射免疫 Balb/c小鼠，于0d、14d各免疫一次，共免疫2次，检测血清 IgG、IgG1、IgG2a、HI效价，进一步用5.0×103个 TCID50的A/Anhui/1/2013(H7N9)野生株攻毒，观察 H7N9裂解疫苗免疫小鼠的存活率、体重、肺病毒载量及肺病理变化。 结果:构建了pHW2000-HA和pHW2000-NA质粒,成功拯救出甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9。制备的甲型H7N9流感裂解疫苗可诱导小鼠体内产生较高的HI抗体效价。IgG1/IgG2a亚型检测结果表明甲型H7N9流感裂解疫苗rgPR8-H7N9诱导小鼠产生体液免疫。攻毒实验显示甲型H7N9流感裂解疫苗15μg剂量即可有效降低小鼠肺部的病毒载量，肺组织病变显著减轻、体重下降后趋于稳定并逐渐恢复，使攻毒小鼠全部存活。 结论:成功拯救甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9，制备的甲型H7N9流感裂解疫苗具有较好的免疫原性及免疫保护性，为H7N9流感裂解疫苗的研发及进入临床研究提供了实验依据。 第二部分喷鼻甲型H7N9流感减毒活疫苗的制备及免疫效果评价 方法:采用反向遗传学技术，以A/Ann Arbor/6/60 ca(H2N2)型流感病毒做为骨架病毒，将其6个内部基因(PB1、PB2、NP、PA、M、NS)及A/Anhui/1/2013(H7N9)疫苗株的HA、NA基因分别构建到双向表达载体pAD3000上，共转染MDCK～COS1细胞，拯救筛选得到冷适应、温度敏感、减毒的甲型H7N9流感减毒活疫苗候选株rgAA-H7N9ca，经放大培养、超滤浓缩、蔗糖纯化制备甲型 H7N9流感减毒活疫苗抗原。将喷鼻甲型H7N9流感减毒活疫苗分为106CCID50、105CCID50、104CCID50三个剂量组，以滴鼻的方式免疫Balb/c小鼠，于0d、14d各免疫一次，共免疫2次，检测血清中HI、IgG、IgG1、IgG2a效价及肺鼻灌洗液中的sIg A效价、，进一步用5.0×103个TCID50的A/Anhui/1/2013(H7N9)野生株攻毒，观察小鼠存活情况。 结果:构建了pAD3000-HA和pAD3000-NA质粒，应用反向遗传学技术成功拯救出冷适应、温度敏感的甲型H7N9流感减毒活疫苗候选株rgAA-H7N9ca。制备的甲型H7N9流感减毒活疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，小鼠体内产生的HI抗体效价第二次免疫明显高于第一次免疫，IgG亚型检测结果显示IgG1/IgG2a均大于1.8，表明甲型H7N9流感减毒活疫苗以诱导小鼠产生体液免疫为主，ELISA方法在小鼠的肺鼻灌洗液中均检测到sIgA。攻毒实验显示制备的甲型H7N9流感减毒活疫苗104CCID50剂量组对小鼠的保护率仅为70％，而106CCID50、105CCID50两个剂量组保护率则达到100%。 结论:本试验成功拯救出的冷适应、温度敏感、减毒的甲型H7N9流感减毒活疫苗候选株rgAA-H7N9ca，喷鼻免疫能够诱导小鼠产生较好的黏膜免疫应答，具有良好的免疫原性及免疫保护性。