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再生障碍性贫血(plastic Anemia, AA,简称再障)是由多种病因导致的骨髓造血功能衰竭性疾病,发病机理多为异常活化的T细胞分泌过多的造血负调控因子,通过某些机制引起造血干细胞的凋亡。从造血干细胞到成熟血细胞的每一个环节都受到复杂的细胞信号转导的调控,这些信号最终靶向转录调控因子,特异性转录因子的表达决定了细胞的分化方向。转录因子GATA-1、PU.1分别调控造血干／祖细胞向红系巨核系和粒单系分化,进而促进血细胞的成熟。EPO介导的JAK2/STAT5信号转导通路及特异转录因子GATA-1在红系发育中至关重要。在“肾藏精,生髓化血”理论的指导下,临床采用补肾益髓生血法治疗再障取得了良好的疗效,在此基础上,本研究采用60Co-γ射线和环磷酰胺(Cyclophosphamide, CTX)联合建立AA大鼠模型,应用流式细胞术、放射免疫法、Western blot和RT-PCR方法,探讨补肾益髓生血法对AA大鼠的治疗作用,并分别探讨其对造血干／祖细胞定向粒单系增殖分化及转录因子PU.1和定向红系增殖分化及JAK2/STAT5信号转导通路、转录因子GATA-1的影响,为AA“肾藏精,生髓化血”理论提供现代生物学依据。目的：动物实验：采用60Co-γ射线与环磷酰胺联合建立AA大鼠模型,观察补肾益髓生血法对AA大鼠药效学及免疫功能的影响。细胞实验：采用半固体甲基纤维素法培养造血祖细胞,检测补肾益髓生血法AA大鼠含药血清对大鼠造血祖细胞集落数目的影响；采用Western blot、RT-PCR方法从分子生物学水平检测补肾益髓生血法对红系细胞JAK2、STAT5、GATA-1蛋白及mRNA表达,粒单系细胞PU.1mRNA表达的影响。方法：1.补肾益髓生血法对60Co-γ射线与环磷酰胺诱导AA大鼠药效学的影响：110只SD大鼠随机分组,正常组10只和造模组100只。采用60Co-γ射线全身一次性照射造模组全部大鼠,照射剂量为4.0Gy。照射4天后,连续腹腔注射环磷酰胺(25mg/kg)3天。将造模组大鼠随机分为模型组、康力龙组、益髓生血组、温肾生血组、滋肾生血组。灌胃用药14天后,检测外周血RBC、WBC、HGB、PLT,瑞氏染色观察血细胞、骨髓细胞形态,计数骨髓有核细胞数量；分离血清用于后期细胞培养。2.流式细胞术：检测外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8变化。3.放射免疫法：检测血清中Fas、FasL、TGF-β1细胞因子的表达。4.造血祖细胞培养及集落计数：分离正常大鼠骨髓单个核细胞、采用半固体甲基纤维素法培养造血祖细胞,在培养体系中加入各组别含药血清,于相应时间计数集落。5. Western blot:检测红系细胞JAK2、STAT5、GATA-1蛋白表达。6. RT-PCR:检测红系细胞JAK2、STAT5、GATA-1mRNA、粒单系细胞PU.、mRNA表达。7.实验数据用SPSS17.0进行统计学处理。结果：1补肾益髓生血法对60co-γ射线和环磷酰胺诱导AA大鼠药效学的影响1.1一般状态：经过补肾益髓生血法治疗后,大鼠精神状态逐渐好转,皮毛光泽度恢复,饮食饮水增加,排尿排便量增多,尤其是贫血症状改善明显,其中以滋肾生血组大鼠一般状态改善最为明显；1.2外周血象：与正常组比较,模型组大鼠RBC、HGB、WBC、PLT显著降低(P<0.01)；与模型组比较,各治疗组RBC、HGB、WBC、PLT均显著性增多(P<0.05,P<0.01)；与益髓生血组、温肾生血组比较,滋肾生血组RBC、WBC、PLT均显著增多,WBC、PLT有极显著统计学意义(P<0.01),RBC有显著统计学意义(P<0.05)。1.3血涂片：模型组较正常组红细胞通透性降低,白细胞减少,退化细胞增多；各治疗组红细胞通透性变好,白细胞增多,血细胞形态趋于正常,退化细胞减少,且滋肾生血组对此作用优于益髓生血组和温肾生血组。1.4骨髓涂片：与正常组相比,模型组大鼠骨髓三系细胞均明显减少,脂肪滴明显增多,有核细胞减少,非造血细胞增加；与模型组比较,各治疗组骨髓细胞脂肪滴减少,有核细胞增多,且滋肾生血组对此作用优于益髓生血组和温肾生血组。1.5骨髓有核细胞数量：模型组骨髓有核细胞显著减少,与模型组比较,各治疗组骨髓有核细胞显著增多(P<0.01),与益髓生血组、温肾生血组比较,滋肾生血组骨髓有核细胞显著增多(P<0.05,P<0.01)。2补肾益髓生血法对60co-γ射线和环磷酰胺诱导AA大鼠免疫功能的影响2.1T细胞亚群的变化：与正常组相比,模型组大鼠CD4显著降低(P<0.01)CD8显著升高(P<0.05), CD4/CD8显著降低(P<0.05)；与模型组比较,各治疗组模型组大鼠CD4、CD4/CD8显著升高(P<0.05,P<0.01),CD8显著降低(P<0.05),以滋肾生血组对此作用最为明显。2.2血清细胞因子的变化：与正常组相比,模型组大鼠血清Fas、FasL显著减少(P<0.01),显著升高(P<0.01)；与模型组比较,各治疗组模型组大鼠Fas、 FasL显著升高(P<0.05,P<0.01),TGF-β1显著减少(P<0.01)3补肾益髓生血法含药血清对大鼠粒单系祖细胞增殖分化及PU.1的影响3.1造血祖细胞CFU-GM数目：与正常对照组相比,模型组造血祖细胞CFU-GM数目明显降低(P<0.01)；与模型组相比,各治疗组造血祖细胞CFU-GM数目均显著增加(P<0.01)。3.2粒单系细胞PU.1mRNA的表达：与正常对照组相比,模型组粒单系细胞PU.1mRNA表达明显降低(P<0.01)；与模型组相比,各治疗组粒单系细胞PU.1mRNA表达明显升高(P<0.01)4补肾益髓生血法含药血清对大鼠红系祖细胞增殖分化及JAK2/STAT5信号转导通路的影响4.1造血祖细胞CFU-E、BFU-E数目：与正常对照组相比,模型组造血祖细胞CFU-E、BFU-E数目均明显降低(P<0.01)；与模型组相比,各治疗组造血祖细胞CFU-E、BFU-E数目显著增加(P<0.01)；滋肾生血组对CFU-E、BFU-E数目的提升明显优于益髓生血组(P<0.01)。4.2红系细胞JAK2、STAT5、GATA-1蛋白及mRNA的表达：与正常对照组相比,模型组JAK2、STAT5、GATA-1蛋白及nRNA表达均明显降低(P<0.01)；与模型组相比,各治疗组JAK2、STAT5、GATA-1蛋白及mRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01),且滋肾生血组对JAK2、STAT5、GATA-1蛋白及mRNA表达的提升明显优于益髓生血组(P<0.05,P<0.01)。结论：1补肾益髓生血法可以改善AA大鼠的一般状态,明显增加外周血RBC、HGB、 WBC、PLT及骨髓有核细胞数量,明显改善AA大鼠血细胞异常形态及骨髓病理改变,对AA大鼠骨髓造血功能有一定的保护作用。滋肾生血法对AA大鼠造血功能的改善作用显著,优于益髓生血组和温肾生血组。2补肾益髓生血法可以增加AA大鼠CD4、CD4/CD8值,降低CD8,增加抗凋亡因子血清Fas、FasL水平,降低造血负调控因子TGF-β1水平,对AA大鼠免疫功能有一定的调节作用。与益髓生血法和温肾生血法相比,滋肾生血法对AA大鼠免疫功能的调节作用显著。3补肾益髓生血法能够增加造血祖细胞CFU-GM数目,提高转录因子PU.1mRNA表达,对造血干／祖细胞定向粒单系增殖分化有一定的促进作用；补肾益髓生血法能够增加造血祖细胞CFU-E、BFU-E数目,提高红系细胞JAK2、STAT5、GATA-1蛋白及mRNA表达,对造血祖细胞定向红系分化成熟有一定的促进作用。滋肾生血法对红系的提升作用较佳,优于益髓生血法、温肾生血法。4补肾益髓生血法对AA大鼠具有肯定疗效,可以改善其造血及免疫功能,促进造血祖细胞增殖分化,可能通过调控JAK2/STAT5信号转导通路来促进红系分化成熟。本研究为“肾藏精,生髓化血”理论提供实验依据。