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植物寄生线虫给人类造成了重大的经济损失,食线虫细菌已经成为生物防治线虫新的突破口,但迄今为止,食线虫细菌侵染线虫的分子机制研究仍然十分有限。在自然条件下,相对宿主线虫来说,食线虫微生物的移动范围有限,但是两者接触是发生侵染的前提条件。因此,病原微生物与其宿主线虫是如何识别并发生作用的,是阐明侵染机理的关键问题之一。在前期有关食线虫芽孢杆菌(B.Nematocida)B16“特洛伊木马”式的细菌-线虫之间的相互关系研究中,我们首次发现,在实验和自然条件下,该线虫病原细菌可以分泌特定的挥发性线虫引诱剂,将线虫吸引到附近并杀死,并确认了其中7种可吸引线虫的信号物质:苯甲醛,苯甲酸苄酯,苯乙酮,2-庚酮,吲哚,萘和2,5-二甲基茴香醚。因此,利用线虫病原细菌主动吸引线虫的特性对高效线虫生防制剂的开发具有重要意义。
针对以上已经鉴定的信号分子在细菌体内如何合成及其调控方式怎样的问题,本文围绕食线虫芽孢杆菌B16吸引线虫这一关键步骤,通过发现群体感应基因的敲除突变株△ComP中吸引线虫能力的下降以及主要信号分子2-庚酮的缺失,再次确认了2-庚酮是吸引线虫的重要信号分子;鉴定、克隆并通过功能实验证实了yneP基因在甲基酮合成中的作用,从而确定了细菌中2-庚酮的合成途径。在此基础上,研究了2-庚酮的合成基因的表达调控方式,证实了群体感应在2-庚酮合成途径中的作用。
本文主要结果为:
1.确定了2-庚酮是食线虫芽孢杆菌B16中重要的信号分子。通过敲除B16群体感应基因comP,发现突变菌株的线虫吸引能力明显下降,GC-MS检测结果显示突变菌株中2-庚酮含量明显减少,说明了2-庚酮在线虫吸引中具有重要作用,并且comP群体感应系统能影响B16中2-庚酮吸引线虫这一过程。
2.解析了重要信号分子2-庚酮的合成途径,并在微生物中鉴定、克隆了一个新的甲基酮合成酶基因yneP。根据番茄属植物中甲基酮合成酶氨基酸序列的分析,在B16菌株中鉴定了与MKS2具有一定同源性(26％的一致性,52%的相似性)的yneP基因,并通过随后的功能实验证实了yneP具有甲基酮合成酶活性,从而首次确定了2-庚酮在细菌中合成的关键酶。
3.通过不同碳源对B16yneP基因启动子表达的影响分析,发现碳源如甘油、葡萄糖、乙醇对yneP启动子启动表达的作用能力大小是:甘油＞葡萄糖＞乙醇,间接证实了细菌中2-庚酮的生物合成途径是通过脂肪酸合成途径完成的。
4.揭示了吸引线虫的重要信号分子2-庚酮合成受到群体感应ComP/ComA双组份系统的调控。从2-庚酮合成过程中相关基因进行表达调控分析,确认了在其前体物质脂肪酸合成途径中的基因fabI、fabZ可能直接受到群体感应ComP/ComA系统的调控,fabF、fabHA、fabHB、fabL基因以及关键酶基因yneP可能受到群体感应ComP/ComA系统的间接调控,从而揭示了群体感应在芽孢杆菌B16中对其致病性的调控。
本论文的创新体现为:
确认了2-庚酮是食线虫芽孢杆菌B16中重要的信号分子,并首次发现细菌中2-庚酮合成的关键酶基因,鉴定出重要信号物质2-庚酮的合成途径。
首次揭示了食线虫细菌群体感应系统中ComP/ComA双组份系统对线虫吸引信号分子2-庚酮合成途径的调控作用。